3.1. Способы освещения

Во флуоресцентной микроскопии используются два способа освещения препарата: проходящим светом и падающим светом.

3.1.1. Освещение проходящим светом

Ход лучей показан на рис. 6.2. Конденсор фокусирует возбуждающий свет в поле зрения микроскопа. Испускаемая флуоресценция собирается объективом и наблюдается с помощью окуляров. При такой конфигурации прибора достаточно двух линз: с помощью одной (конденсор) фокусируется возбуждающий свет, с помощью другой (объектив) собирается испускаемый свет. Для получения оптимальных условий наблюдения две эти линзы, имеющие собственные оптические оси, должны быть хорошо отъюстированы. Достичь точной юстировки и затем поддерживать ее при постоянной работе не так просто. Недостатком освещения проходящим светом является то, что при освещении светлопольным конденсором практически весь возбуждающий свет попадает в объектив. Поскольку интенсивность возбуждающего света часто на несколько порядков выше интенсивности света флуоресценции, то для их разделения требуются фильтры очень высокого качества. Чтобы избежать этой проблемы, можно воспользоваться темнопольным конденсором, который освещает препарат под таким углом, что никакой прямой возбуждающий свет не попадает в объектив. Это содействует разделению возбуждающего света и света флуоресценции, которое в основном производится с помощью запирающих светофильтров. Но, с другой стороны, темнопольные конденсоры пропускают намного меньше возбуждающего света, чем светлопольные конденсоры. В случае применения проходящего света в сочетании с объективами большой оптической силы требуется помещать между конденсором и предметным стеклом иммерсионное масло, что также создает неудобства при постоянной работе. Недостатком освещения проходящим светом является и то, что трудно совмещать флуоресценцию с фазовым контрастом или светлопольной микроскопией.

3.1.2. Освещение падающим светом

Данный тип флуоресцентной микроскопии показан на рис. 6.3. Для фокусировки возбуждающего света на препарат и собирания испускаемого флуоресцирующим препаратом све­та используется только одна линза — объектив. Для отделения испускаемого света флуоресценции от не поглощенного возбуждающего света используется зеркало специального типа — цветное светоделительное зеркало (СДЗ, иногда называемое дихроичным зеркалом), которое располагается при флуоресцентной микроскопии на пути падающего света над объективом. Эти зеркала имеют специальное интерференционное покрытие, которое отражает на препарат свет, длина волны которого меньше определенного значения, и пропускает более длинноволновый свет флуоресценции в окуляры. Более того, возбуждающий свет, отраженный от препарата или от оптических деталей микроскопа и идущий в окуляры, эффективно отражается СДЗ и не попадает, таким образом, в окуляры. В принципе СДЗ работает и как возбуждающий, и как запирающий фильтр, но на практике нужен дополнительный запирающий фильтр для того, чтобы удалить остатки возбуждающего света.

Преимуществом эпиосвещения является то, что одна и та же система работает и как конденсор, и как объектив. Таким образом, фокусируя данный объектив на препарате, вы одновременно получаете правильную настройку всей данной части микроскопа. Освещаемое поле является полем зрения. При использовании масляно-иммерсионного объектива достаточно нанести масло на препарат, тогда как при работе в проходящем свете для получения максимальной интенсивности освещения необходимо еще нанести масло на высокоапертурный конденсор. Кроме того, эпиосвещение позволяет легко переходить от флуоресцентной микроскопии к микроскопии в проходящем свете, так как нижнее освещение остается легкодоступным. Последнее обстоятельство в ряде случаев имеет большое значе­ние, например при использовании иммунофлуоресценции в со­четании с фазово-контрастной микроскопией.