1. Флуорохромы

Флуоресцирующие красители используются в достаточно низкой концентрации, в которой они не токсичны для клеток и в то же время дают достаточно яркое изображение на черном фоне. Применявшиеся в прошлом нефлуоресцирующие красители давали цветное окрашивание за счет поглощения света, поэтому, чтобы получилось видимое для глаза поглощение, они должны были при­меняться в значительной концентрации. В таких количествах красители обычно токсичны.

Флуоресцентные красители нужны в очень малых количест­вах, и нет надобности применять токсические концентрации. Плоэм [19] пишет о возможности использования акридиново­го оранжевого в разведении 1:100000 на фосфатно-солевом буфере для окрашивания макрофагов и фибробластов.

Вещества, флуоресцирующие при освещении, называются «флуорофорами или флуорохромами. Различные флуорохромы характеризуются специфическими спектрами поглощения и испускания. Спектры поглощения или испускания определяют путем измерения относительной интенсивности флуоресценции при определенной длине волны, когда препарат возбуждается светом различных длин волн. Наиболее интенсивная флуоресценция наблюдается тогда, когда препарат облучается светом 'С длиной волны, близкой к максимуму на кривой возбуждения. Кривая испускания определяется при возбуждении светом опре­деленной длины волны. Примеры спектров поглощения и ис­пускания приведены на рис. 6.1. В большинстве случаев кривые поглощения и испускания частично перекрываются. Другой характеристикой флуорохромов является их квантовая эффективность (Q), которая определяется как соотношение между поглощенной и выделенной энергиями. Флуорохромы с низкой Q, которые испускают мало света по сравнению со своим уровнем поглощения, относятся к слабым флуорохромам.

Снижение интенсивности флуоресценции во время освещения называется выцветанием. Степень выцветания зависит от интенсивности возбуждающего света и времени экспозиции [7]. Уменьшение флуоресценции может быть также следствием модификации возбужденного состояния флуорофора. Эти физико-химические изменения могут быть вызваны наличием других флуорофоров, окислителей или солей тяжелых металлов. Данный процесс называется тушением и является весьма сложным. Для того чтобы замедлить снижение уровня флуоресценции, приготовленные флуоресцирующие препараты лучше всего хранить при +4°С в темноте.

3. Флуоресцентный микроскоп

Флуоресцентный микроскоп должен отвечать двум основным требованиям. Во-первых, возбуждение флуорофора в препарате должно быть эффективным и желательно, чтобы оно происходило при длинах волн, близких к максимуму его поглощения [10]. Во-вторых, микроскоп должен собирать как можно больше света флуоресценции.

Три компонента необходимы для наблюдения флуоресценции: флуорофор, источник света и блок регистрации флуоресценции. Помимо этих необходимых элементов, требуются фильтры для выделения подходящих длин волн возбуждения (возбуждающие фильтры) и испускания (запирающие фильтры), а также дополнительные линзы. Флуоресценцию можно наблю­дать визуально, фотографировать, или измерять при помощи фотоумножителя (ФЭУ).