Глава 4

Иммуногистохимия

185

1«

(сноска к табл. 4.10). Если трудности возникают при приме­нении препарата вторых антител, то его следует заменить, взяв препарат, полученный из другого источника.

8. Совместное определение двух антигенов на одном срезе

Совместное применение двух антител на одном и том же срезе требует особых предосторожностей. Если антитела были получены от животных разных видов, то можно воспользоваться непрямым методом с двумя по-разному маркированными вторыми антителами, предварительно отобранными так, чтобы между ними не было перекрестной реакции. Если два первых антитела получены от одного животного, что при работе с мышиными моноклональными антителами встречается часто, то можно провести полное иммуногистохимическое окрашивание сначала на первый антиген, а затем такое же окрашивание на второй антиген, используя различные ферменты (образование окрашен­ного осадка часто препятствует взаимодействию первого анти­тела со вторым набором реактивов). Если данный метод не работает, то следует либо воспользоваться прямым методом, когда к каждому антителу присоединяется его собственная метка, либо присоединить к каждому антителу отличающую его молекулу. Например, одно антитело может быть биотинировано и затем выявлено с помощью авидина, а второе соединено с ДНФ и выявлено антителами к ДНФ.

Правильный порядок применения реактивов должен быть установлен эмпирически. Если используются антитела от различных видов животных, то можно достичь хороших результатов, применяя одновременно оба первых, а затем оба вторых антитела, и теоретически такая схема всегда будет работать хорошо. Однако иногда лучшие результаты получаются, если реактивы используют последовательно.

Ферментные метки дают удовлетворительные результаты, если два антигена располагаются на разных клетках (например, когда необходимо различить два трансплантационных антигена у химерной мыши), либо в разных клеточных компартментах (например, ядро и плазматическая мембрана). Если этого нет, то трудно бывает с уверенностью отличить единично и дважды меченные клетки. В этом случае надо воспользоваться флуо­ресцентными метками и микроскопом, который позволяет опе­ратору быстро переключать комбинации светофильтров (напри­мер, светофильтры, подобранные для флуоресцеина, заменять на светофильтры для родамина, и наоборот) во время наблюде­ния одной и той же клетки.

9. ДНК-зонды для гибридизации in situ

9.1. Принцип метода гибридизации

Существует возможность размножать протяженные участки ДНК млекопитающих в бактериях или дрожжах. Один из методов состоит в использовании плазмид, которые являются маленькими кольцевыми молекулами двуспиральной ДНК. Плазмиды реплицируются одновременно с ДНК хозяина. Благодаря маленьким размерам плазмид их ДНК легко отделить от ДНК бактерий или дрожжей, где они находятся. С помощью специальных ферментов в плазмиды могут быть встроены короткие отрезки чужеродной ДНК, которые затем размножаются за счет роста бактериальной клетки-хозяина. Культуры клонируют, и колонию, содержащую ДНК необходимой длины, выделяют. Эту колонию можно культивировать и получить тем самым неисчерпаемый источник определенного участка молекулы ДНК.

Если двуспиральную ДНК нагреть, то ее цепи разъединяются. Этот процесс называется денатурацией. При охлаждении комплементарные цепи воссоединяются, или ренатурируют. Одноцепочечная ДНК будет также соединяться с комплементарной мРНК. Если подходящим образом пометить клонированную ДНК, то ее можно использовать в качестве метки для выявления комплементарной последовательности ДНК или мРНК. Зонды для определения мРНК могут быть использованы для выявления синтеза какого-либо специфического белка, который слишком лабилен или выводится из клетки слишком быстро, чтобы его можно было определить иммуногистохимически. Другие пробы могут быть направлены на выявление вирусной ДНК в клетках или для исследования геномной ДНК.

Часто для мечения ДНК используется процесс, называемый ник-трансляцией (от английского nick — разрезать). В присутствии ДНК-полимеразы и четырех нуклеотидтрифосфатов (один из которых содержит метку) в одну из цепей ДНК с помощью фермента вносятся разрывы. Полимераза восстанавливает заново одну цепь ДНК, используя неповрежденную в качестве матрицы.

Для гистохимических целей ДНК может быть помечена изотопом и выявлена с помощью радиоавтографии. В некоторых случаях получаемое с помощью радиоавтографии разрешение недостаточно высоко; кроме того, радиоавтография часто дает большой фон, и процесс экспозиции занимает до недели и более. Введение в ДНК биотина позволяет воспользоваться иммуно-гистохимическими методами. Они более быстрые и позволяют лучше определять локализацию исследуемого вещества, хотя в настоящее время данные методы менее чувствительны, чем радиоавтография.

В истории развития люминесцентной микроскопии выделяют несколько этапов, связанных с усовершенствованием методики:

1. доказательство А. Келером принципиальной возможности создания люминесцентного микроскопа;

2. создание в 1911 г. Люминесцентного микроскопа, который был использован русским ботаником М.С. Цветом для изучения люминесценции хлорофилла растительных клеток;

3. применение сильно разбавленных растворов флюорохромов, избирательно связывающихся с определёнными структурами клеток [М. Хайтингер, 1933-1935], и прежде всего акридинового оранжевого [Хайтингер, Штруггер, 1940]

4. разработка метода возбуждения люминесценции падающим светом через объектив микроскопа с использованием интерференционной светоделительной пластинки [Е.М. Брумберг и Г. Н. Крылова, 1953]

5. выпуск отечественной промышленностью люминесцентных микроскопов и устройств, основанных на этом принципе.

6. создание метода иммунофлуоресценции, нашедшего широкое применение в микробиологии, иммунологии и других областях медико – биологических исследований. [А. Н. Кунс, 1942]

Флуоресцентная микроскопия

В основе флуоресцентной микроскопии лежит способность некоторых веществ поглощать свет определенной части спектра, энергия которого затем частично выделяется в виде света. Испускаемый свет отличается от поглощенного света длиной волны и интенсивностью. В соответствии с правилом Стокса длина волны испускаемого света больше, чем длина волны поглощаемого света, и эта разность длин волн лежит в основе наблюдения флуоресценции при флуоресцентной микроскопии. Интенсивность испускаемого света меньше, чем интенсивность, возбуждающего света, так как количество выделяемой энергии во много раз меньше того количества энергии, которое требу­ется для возбуждения.

Метод исследования в свете люминесценции (люминесцентная микроскопия, или флуоресцентная микроскопия) заключается в наблюдении под микроскопом зелено-оранжевого свечения микрообъектов, которое возникает при их освещении сине-фиолетовым светом или не видимыми глазом ультрафиолетовыми лучами

Для наблюдения флуоресценции необходимо предотвратить смешение в микроскопическом изображении возбуждающего света и испускаемой флуоресценции. Качество изображения во флуоресцентной микроскопии в значительной степени определяется контрастом и яркостью изображения. Контраст изображения определяется отношением флуоресценции специфически окрашенных структур к фоновому свету. Однако оптимальный контраст может достигаться в слабых флуоресцентных изображениях благодаря, например, использованию узкополосных светофильтров, которые часто имеют небольшое пропускание. В то же время для облегчения визуальных наблюдений, для фотографирования с использованием относи­тельно коротких выдержек и для измерений требуется сравнительно яркое изображение. Таким образом, в большинстве случаев необходимо достичь компромисса между интенсивностью специфической флуоресценции и уровнем неспецифической флуоресценции фона.