5.4. Системы с использованием биотин — авидина

Авидин — белок, экстрагируемый из яичного белка, — содержит четыре участка связывания, обладающих высоким сродством к биотину из печени. Биотин можно ковалентно связать с первичными или вторичными антителами, которые затем выявляют, используя меченый авидин (рис. 4.6). Авидин имеет изоэлектрическую точку при рН, близком к 10, и положительно заряжен в нейтральных буферах. Поэтому в ткани он должен предпочтительно связываться с отрицательно заряженными молекулами. Стрептавидин, выделенный из Streptomyces avidinii, также содержит четыре участка связывания с биотином, но его изоэлектрическая точка близка к 7.

Для мечения фермента лучше не прямо соединять белок с авидином или стрептавидином, а связать его с биотином и использовать немеченый авидин в качестве мостика. Для увеличения чувствительности эта система может использоваться способом, аналогичным методу фермент—антифермент. Вместо меченого авидина наносится комплекс биотинированный фермент—авидин — так называемый ABC-метод (комплекс авидина со связанной с биотином пероксидазой). Показано, что этим способом можно получить комплекс больших размеров, чем тот, который получается при использовании метода фермент—антифермент, т. е. достигнуть большей чувствительности.

Рис. 4.6. Биотин—авидиновый метод.

1 — первое антитело;

2 — биотинированное второе антитело;

3 — меченый авидин.

При использовании авидина или стрептавидина для работы на срезах печени необходимо соблюдать осторожность, учитывая наличие эндогенного биотина в этой ткани.

Описанный выше метод может использоваться в различных комбинациях. Для повышения чувствительности антитела должны быть связаны с другими антителами. Однако, за исключением особых случаев, это не всегда необходимо и часто нежелательно. В том случае, когда антиген явно разрушен при фиксации ткани, его присутствие может быть обнаружено с помощью высокочувствительного метода. Но и тогда повышенная чувствительность будет приводить к появлению слабых перекрестных реакций и усилению неспецифического окрашивания. В любом случае, если только это возможно, предпочтительнее правильно выбирать условия обработки ткани.

7. Решение возникающих проблем с помощью контрольных препаратов

При проведении гистохимических и иммуногистохимических реакций возникают два типа проблем: с одной стороны, появление нежелательной окраски и, с другой стороны — неожиданное отсутствие окраски. Эти проблемы решаются путем постановки соответствующих контролей.

7.1. Контрольные препараты

Необходимо делать контрольные препараты двух видов — положительный и отрицательный контроли. При использовании каждого антитела необходимо выбрать блок ткани, заведомо содержащий данный антиген, и сделать с него большое количество срезов. Один из них будет использоваться в каждой окраске для того, чтобы по нему определять интенсивность реакции окрашивания.

При каждой окраске в числе препаратов должен также быть препарат исследуемой ткани, на который при постановке реакции не были нанесены первые антитела. Это нужно для проверки на неспецифическое окрашивание, которое могут давать реагенты, используемые для выявления первых антител. Если применяется прямой метод окраски, то данный контроль можно пропустить. При ферментативном методе выявления ан­тител в качестве контроля применяется препарат, на котором для проверки активности эндогенных ферментов ставится только сама цветная реакция.

Вышеуказанные контроли, хотя и являются необходимыми, не позволяют выявить неспецифическое связывание первых ан­тител. При использовании поликлональных антител для этого можно взять их аликвоту и истощить антитела исходным анти­геном. Это позволяет уменьшить специфическое окрашивание и обнаружить неспецифическое окрашивание, однако не позволя­ет выявить эпитопы Данный контроль не обязательно ставить при каждом окрашивании, но если антиген легко доступен, то контроль надо поставить на одном-двух препаратах при первом использовании новой антисыворотки. Применительно к моно-клональным антителам этот тип контроля не имеет смысла. Тестовый препарат может служить контролем сам по себе. Распределение антигена в нем скорее всего известно: например, антитела к Т-лимфоцитам не будут окрашивать эпителиальные клетки. Нужные структуры в нем будут хорошо окрашены, а все остальные останутся прозрачными. Если у вас окрасились «не­правильные» клетки, то это дает основание подозревать наличие неспецифического связывания. В частности, «грязный» фон на препарате при недостаточной отмывке дают мышечные клетки стромы.

7.2. Решение проблем

При решении возникающих проблем нужно исходить из про­стой логики. Описанные выше контроли должны указывать на то, в какой части процедуры присутствует ошибка. Вам^ в свою очередь следует тщательно проверить каждый шаг. Часто ис-

точником трудностей является какая-нибудь мелочь. Желатель­но, например, использовать предметные стекла, матированные с одной стороны, и четко помечать их карандашом. Без этого бывает иногда трудно отличить одну поверхность предметного

[стекла от другой, и таким образом, можно окрасить не ту сто-

• рону.

I Существует три типа неправильного окрашивания: недоста­точное, избыточное и неспецифическое окрашивание. Полное отсутствие окраски на положительном контрольном препарате часто указывает на то, что был случайно пропущен реактив или было взято не то вещество. Если окрашивали одновременно много срезов с использованием различных антител, то, вероят­но, ошибка относится ко второму антителу, которое использова­ли в данной окраске (например, взяли антикроличьи антитела при окраске срезов мышиными антителами).

Слабая окраска указывает на то, что один из наиболее ла­бильных реактивов был испорченным. Например, при использо­вании окрашивания пероксидазой необходим свежий раствор Н2О2. Для предотвращения роста бактерий в буферных раство­рах к ним часто добавляют азид натрия. Азид ингибирует мно­гие ферменты, так что использование буфера с азидом может вызвать трудности при проведении реакции с хромогеном.

Избыточное окрашивание часто является следствием ошибки в разведении одного из реактивов. Проблемы могут возникать также из-за температуры. Большинство исследований прово­дятся обычно при комнатной температуре, которая в помеще­ниях, где нет кондиционера, может различаться на 10 °С. Ско­рость ферментативных реакций резко возрастает с увеличением температуры, так что методика окрашивания, разработанная в холодный день, может привести к образованию избыточного цветного продукта в жаркую погоду.

Если объем раствора антител недостаточен для того, чтобы как следует покрыть срезы, то следует помнить, что любое ис­парение во время инкубации приведет к повышению концентра­ции антител в срезе, что приведет к избыточному окрашиванию. В предельном случае, если раствор на части срезов полностью высох, появится интенсивное фоновое окрашивание.

Избыточное окрашивание приводит к усилению неспецифи­ческого окрашивания. Кроме того, если данная проблема воз­никает постоянно, то следует обратить особое внимание на про­цедуры, связанные с отмывкой препаратов, в частности на воз­можное присутствие белка в буфере. Если трудности возникают на стадии применения первых антител, то можно попробовать предварительно инкубировать срезы в течение 15 мин в раство­ре ФСБ, содержащем 5% сыворотки от другого вида животного

184