5.2. Непрямой метод
Вторые антитела получают к иммуноглобулинам животных того же вида, из которого получены используемые для определения интересующего антигена первые антитела. Срезы инкубируют с первыми антителами, отмывают и затем инкубируют с мечеными вторыми антителами (рис. 4.3,Б).
Основное преимущество данного метода состоит в том, что для целой серии различных первых антител необходим только один препарат меченых вторых антител. Это значительно уменьшает объем работ и, кроме того, позволяет более экономно использовать первые антитела, так как при проведении химической модификации часть реактива всегда теряется. Непрямой метод более чувствителен, чем прямой, поскольку с каждой молекулой первого антитела может реагировать более одной молекулы вторых антител.
Особенно большой чувствительностью обладает вариант непрямого метода, когда вторые антитела адсорбируются на частицах коллоидного золота.
5.3. Методы, основанные на взаимодействии фермент—антифермент
Этот вариант непрямого метода используетсй для повышения чувствительности. В иммуногистохимии в качестве метки часто используется фермент. Для простоты описания предположим, что первые антитела получены из крови кролика. Антитела к ферменту по происхождению также кроличьи. Кроме того, требуются немеченые антитела (например козьи) к IgG кролика.
Как показано на рис. 4.4, срез инкубируют с первыми (кроличьими) антителами, отмывают, затем инкубируют с избытком козьей антикроличьей сыворотки и снова отмывают. Раствор комплекса фермент—антифермент готовят, добавляя к раствору фермента полученную против него кроличью сыворотку. Затем смесь наносят на препарат, а после инкубации и промывки проводят цветную ферментативную реакцию.
Поскольку иммуноглобулины представляют собой димеры, они могут реагировать с двумя различными молекулами антигена. Если фермент несет более одного эпитопа, а фермент и антитело находятся в смеси в соответствующих концентрациях, то будет образовываться сеть из поперечно связанных молекул фермента и антитела. Цель применения козьей сыворотки про тив кроличьих IgG состоит в том, чтобы связать комплексы [фермент—антифермент с первыми антителами.
-
Рис … Метод фермент—-антифермент 1—первое антитело; 2 — второе [(связывающее) антитело; 3 — комплекс фермент—антифермент (антитело к |ферменту) Заметьте, что первые антитела и антитела к ферменту должны быть получены из животных одного вида
Преимущество данного метода состоит в его большей чувствительности — количество молекул метки, присоединяющихся к каждой молекуле первого антитела, может увеличиваться. Исключается, кроме того, необходимость ковалентного связывания фермента со вторым антителом. Недостатками являются потребность в дополнительных реактивах (сыворотка, полученная против фермента) и большая продолжительность эксперимента, связанная с появлением в цепочке реакций дополнительных стадий.
Если используемый фермент — пероксидаза хрена, то метод называется РАР (пероксидаза — антитела к пероксидазе); часто применяется также набор АРААР (щелочная фосфатаза — антитела к щелочной фосфатазе).