4.3. Коллоидное золото

В этом методе используются частицы коллоидного золота с адсорбированными на них антителами. Исходно методика была создана для электронной микроскопии, где она обладает тем преимуществом, что можно различить отдельные частицы золота, поскольку они обладают высокой электронной плотностью. Применение различных антител, меченных частицами золота различного диаметра, позволяет одновременно локализовать два или даже три антигена. При использовании в световой микроскопии частицы золота визуализируют с помощью реакции преципитации серебра. Метод, как оказалось, более чувствителен, чем те, в которых применяются ферментные метки.

С тех пор, как мечение коллоидным золотом стало обычно использоваться при непрямом методе, несколько фирм выпускают необходимые реактивы, и лучше всего пользоваться ими. Можно также приобрести препарат стрептавидина, адсорбированного на частицах коллоидного золота. Он может быть использован в сочетании с антителами, конъюгированными с био-тином.

4.4. Выбор метки

Не существует правильного или неправильного выбора метки. Выбор должен определяться особенностями изучаемой ткани. Так например, щелочная фосфатаза будет скорее всего неудачным выбором, если предполагается исследовать ткань кишки, в которой содержится много этого фермента. Желательно не применять пероксидазу, если ткань содержит большое количество эндогенной пероксидазы или коричневого пигмента (который можно спутать по цвету с обычно применяемым субстратом пероксидазы), особенно в тех случаях, когда на антиген могут влиять процедуры, применяемые для удаления эндогенной пероксидазы или пигмента. Другим немаловажным фактором является доступность меченых реактивов, так как обычно гораздо легче и дешевле купить необходимые реактивы, чем метить антитела в лаборатории. Окончательный выбор зависит от личных симпатий исследователя.

5. Методы окраски

Простейший метод выявления антигена на срезе ткани заключается в применении меченых антител (прямой метод). Однако более распространен так называемый непрямой метод, когда первые антитела не помечены, а метка соединена с другим реактивом, который используется для обнаружения первых антител. Например, если первые антитела — IgG мыши, их можно обнаружить с помощью меченых козьих антител, полученных против IgG мыши (непрямой метод).

Из описанных ниже методов прямой метод дает результаты наиболее быстро. Непрямой метод прост в использовании и вполне приемлем по чувствительности, тогда как методы, основанные на использовании взаимодействия фермент — антифермент и конъюгированного с антителами коллоидного золота, являются наиболее чувствительными. Здесь, как и во многих других вопросах, нет единственного «правильного» решения, и выбор часто определяется индивидуальными пристрастиями исследователя.

5.1. Прямой метод.

Метка непосредственно связывается с первыми антителами (рис. 4.3,А). Для этого Ig должен быть хорошо очищен. Преимущество метода в его быстроте — он состоит только из одной стадии. Недостатки его заключаются в том, что он менее чувствителен по сравнению с другими методами, а также в необходимости метить отдельно каждое антитело, что связано с большой работой и часто с потерей ценных реактивов.

Р ис. Прямой (А) и непрямой (5) методы визуализации с помощью антитела реакционно-способного участка на срезе ткани: 1 — первое антитело; 2 — меченое второе антитело.