4.2. Ферментные метки

Когда в качестве метки используются ферменты, то визуализация обусловлена образованием в ходе реакции нерастворимых окрашенных продуктов. Идеальная ферментная метка должна иметь низкий молекулярный вес (для того, чтобы легко связываться с Ig) и высокую скорость оборота ферментативного цикла (для большего выхода продуктов реакции). Этот фермент должен отсутствовать в нормальной ткани и давать продукты реакции, нерастворимые в воде, этаноле и ксилоле.

4.2.1. Пероксидаза хрена

Пероксидаза хрена была первым ферментом, использованным в качестве метки, она остается популярной и в настоящее время. Пероксидаза хрена удовлетворяет всем перечисленным выше условиям за исключением того, что этот фермент обнаруживается в нормальной ткани, в частности в гранулоцитах, эритроцитах и клетках миелоидного ряда. Обычно необходимо блокировать активность эндогенного фермента ткани. Субстратом является перекись водорода, а продукт реакции вызывает окисление хромогена. В качестве последнего чаще всего используется диаминобензидин (ДАБ), который образует коричневый осадок (преципитат) в месте реакции. Преимуществом данного красителя во всех случаях является его устойчивость. Необходимо следить за тем, чтобы не спутать продукт реакции с эндогенным пигментом коричневого цвета.

4.2.2. Щелочная фосфатаза

Субстратом для этого фермента обычно является нафтол-фосфат в сочетании с солью диазония. Фосфатаза высвобождает нафтол, который, соединяясь с солью диазония, образует преципитат. При связывании его с быстрым красным образуется осадок красного цвета, растворимый в спирте и ксилоле, так что для заключения препарата под покровное стекло должна использоваться водорастворимая среда. Щелочная фосфатаза обнаруживается в ряде тканей, включая костный мозг, эндотелий, почку, плаценту и кишечник. Изофермент щелочной фосфатазы, обнаруживаемый в кишечнике, отличается повышенной устойчивостью. Он выдерживает многие воздействия, приводящие к разрушению этого фермента в других местах. Красный цвет хорошо улавливается глазом, и эта метка особенно удобна, если требуется обнаружить единичные клетки, например микрометастазы в мазках костного мозга. Недостатком метода является постепенное обесцвечивание продуктов реакции в течение нескольких месяцев.

4.2.3. Глюкозооксидаза

Глюкозооксидаза обнаружена в клетках бактерий и отсутствует в тканях млекопитающих. Субстрат реакции окисляется в присутствии соли тетразолия и акцептора водорода — феназин-метасульфата. В результате окисления тетразолий дает окрашенные кристаллы, которые, в случае использования нитросинего производного, имеют синий цвет. Если нужно пометить на одном и том же срезе два антигена, то данная окраска дает хороший контраст с продуктом окрашивания щелочной фосфатазы. Если требуется докрасить клеточные ядра, то можно использовать метиловый зеленый.

4.2.4. Галактозидаза

Фермент β-галактозидаза, выделяемый из Escherichia coli, легко коньюгирует с другими белками. Оптимальный рН для бактериального фермента (7,0—7,5) отличается от оптимального рН для β-галактозидазы человека (5,0—5,6), так что при использовании правильно подобранного буфера нет необходимости специально блокировать эндогенный фермент. Более того, эндогенный фермент инактивируется при нагревании выше 55 ^ОС, поэтому заключенная в парафин ткань уже не содержит активного фермента.

4.2.5. Ферменты, конъюгированные с антителами

В настоящее время некоторые фирмы производят ряд высококачественных препаратов конъюгатов вторых антител. Если можно приобрести коммерческий препарат, то производить конъюгаты в лабораторных условиях не рекомендуется.

Существует три общепринятых метода конъюгации, в которых используются глутаровый альдегид, периодат или какой-либо бифункциональный реактив. В первом случае Ig и фермент могут быть непрочно соединены глутаровым альдегидом. Этот метод успешно используется для связывания антител со щелочной фосфатазой.

Пероксидаза хрена содержит много углеводных остатков; в результате обработки периодатом альдегидные группы могут образовываться на сахарах, содержащих близко расположенные гидроксильные группы. Альдегидные группы будут реагировать с остатками лизина в молекуле Ig, при этом после восстановления образуются стабильные связи.