3.1. Выбор условий обработки ткани

Начиная работу с новыми антителами, необходимо подобрать оптимальные условия фиксации и обработки ткани. И хотя эти условия устанавливают только эмпирическим путем, можно наметить некоторые направления поиска.

Нужно отобрать несколько фиксаторов. Применяют формалин, метакарн (метанольный Карнуа – 60% метанола, 30% хлороформа, 10% ледяной уксусной кислоты), 90%-ный этанол, раствор Буэна, хлороформ—ацетон и кальций—формол с последующей обработкой смесью хлороформа с ацетоном. Пригодность каждого из фиксаторов проверяется на наборе срезов, полученных с замороженных тканей. С ткани, содержащей интересующий антиген, делают несколько замороженных срезов и погружают их по одному на 5 мин в каждый из выбранных фиксаторов. Далее срезы окрашивают антителами, используя выбранный для этого метод, и анализируют результаты. Если оказывается, что все выбранные фиксаторы разрушают антиген, эксперимент следует повторить, используя более мягкие фиксаторы (например, параформальдегид — лизин — периодат). Иногда окрашивание должно выполняться на срезах без предварительной фиксации материала. Следует учитывать, что на таких срезах плохо видна общая морфология ткани.

Если антиген сохраняется при использовании одного или более фиксаторов, ткань фиксируют в том из них, который кажется наиболее подходящим, и заливают в парафин. Далее изготавливают и окрашивают срезы. Если антиген разрушается в процессе заливки, то необходимо использовать парафин с более низкой температурой плавления (45° вместо 58°С). На этой стадии можно при необходимости выбрать оптимальные условия с учетом особенностей антител.

Антигены, найденные на поверхности лимфоидных клеток, такие как антигены гистосовместимости, а также специфические маркеры субклассов лимфоцитов часто бывают нестабильными. Для сохранения их целостности следует принять определенные меры предосторожности.

Необходимо учитывать, что фиксатор может неодинаково действовать на разные эпитопы антигена. Если имеется несколько моноклональных антител к одному и тому же антигену, то для каждого из них оптимальные условия обработки среза должны подбираться отдельно.

Срезы кальцинированной ткани, например метастазировавшей в кость опухоли, обычно перед окраской декальцинируют 5%-ной муравьиной кислотой или 0,5 М ЭДТА. Если антиген выдерживает фиксацию солевым раствором формалина, то он обычно выдерживает и процедуру декальцинации.

Выбор способа мечения

Метки, используемые для визуального выявления антител, делятся на три класса: флуоресцентные метки, ферментные метки и метки, в состав которых входит золото (такую метку можно усилить серебром). Возможно также использование радиоактивной метки, с последующей радиоавтографией.

4.1. Флуоресцентные метки

Идеальная флуоресцентная метка характеризуется высоким квантовым выходом, а также тем, что длины волн возбуждения и испускания достаточно различаются. При этом максимум поглощения должен находиться вблизи мощной линии свечения дуговой ртутной лампы (которая обычно используется во флуоресцентной микроскопии), а длина волны испускаемого света должна быть приемлема одновременно и для человеческого

Преимуществом использования метода флуоресцентных меток является его быстрота. Результат можно получить сразу после того, как препарат был проинкубирован с мечеными антителами и заключен под покровное стекло. К недостаткам метода относится прежде всего необходимость использования специального оборудования, а также то, что исследователю приходится работать буквально в темноте. Кроме того, при помощи данного метода не выявляются архитектура ткани и морфология клеток Хотя раньше в иммуногистохимии использовались антитела, меченные флуоресцеином, в настоящщее время эта техника вытесняется методами с использованием ферментов, за исключением тех случаев, когда необходимо на одном и том же срезе выявить два различных антигена.