2.3. Моноклональные антитела

Многих упомянутых выше проблем можно избежать, если использовать моноклональные антитела. Моноклональные антитела получают с помощью клонированной линии клеток, продуцирующих единственный Ig. Эти клетки получают путем слияния клеток селезенки иммунизированных животных и клеток линии миеломы, чувствительных к воздействию определенного яда. После слияния клетки инкубируют в присутствии этого яда. В таких условиях расти будут только клетки-гибриды, появившиеся в результате слияния нормальных клеток селезенки (которые не чувствительны к действию яда) и клеток миеломы (от которых гибрид получает бессмертие). Гибриды клонируют, выбирают клоны, вырабатывающие специфические антитела, и выбранные клоны клонируют вновь. Каждая из получающихся в результате клеточных линий (их называют гибридомами) производит неограниченное количество определенного Ig.

2.4. Очистка антител

Перед тем, как связать антитела с меткой, иногда необходимо произвести их очистку. Это сравнительно легко сделать, если используются моноклональные антитела из супернатанта культуры гибридомы, — достаточно осадить их сульфатом аммония и затем провести хроматографию. Если используются моноклональные антитела из асцитной жидкости или поликло-нальная сыворотка, желательно отделить специфические антитела от других Ig. Лучший способ — иммобилизовать антиген на твердый носитель и воспользоваться аффинной хроматографией.

2.5. Специфичность реакций антител

Важнейшим свойством Ig является сродство, или аффинность, к своему антигену. Необходимая для эксперимента концентрация зависит именно от этого сродства. «Сила» поликлональной сыворотки прямо связана с концентрацией антител, умноженной на константу сродства: чем выше сродство, тем больше эффективное разведение. По причинам, перечисленным ниже, антитела с высоким сродством обычно обнаруживают большую специфичность.

Антитела используют в качестве реагентов из-за их высокой специфичности. Однако необходимо заметить, что они могут вызывать также неспецифические реакции. Это может происходить по трем причинам.

1. Из-за загрязненности антител. Это бывает только при использовании поликлональной антисыворотки и может быть обнаружено с помощью соответствующих контролей. Кроме того, вероятность таких осложнений снижается, если можно использовать антисыворотку в высоком разведении.

2. Из-за наличия перекрестных реакций. Такая ситуация возникает, если две молекулы имеют подобные, но все же различающиеся структуры. Некоторые антитела способны узнавать обе молекулы, и часто при нежелательной реакции сродство антител ниже, чем в основной реакции, так что проблема возникает только при использовании антител в слишком высокой концентрации. По этой причине также желательно использовать антитела с высоким сродством.

3. Из-за того, что две молекулы имеют одинаковый эпитоп. Эту возможность нельзя проверить с помощью обычных контролей. Обычно ее можно определить только с помощью детального иммунохимического изучения.

3. Воздействие на антигены процедуры обработки ткани

Прежде чем применять антитела, необходимо приготовить срезы исследуемой ткани. Перед тем как решить, каким образом подготовить ткань для изготовления срезов, необходимо учесть воздействие каждой из процедур, используемых в ходе этой подготовки, на антиген.

Обычно, когда срезы предполагается окрашивать гематоксилином и эозином, ткань фиксируют, чаще всего формалином, и заливают в парафин. После изготовления срезов парафин удаляют, погружая препарат в ксилол или подобный ему растворитель; далее переносят через спирт в воду. При такой обработке получаются срезы высокого качества, но она приводит к изменению структуры тканевых белков, так что многие антигены теряют способность реагировать с соответствующими ан­тителами. В этом случае можно попытаться применить другие методы фиксации и обработки ткани, но часто приходится делать срезы с замороженной ткани.