152

Препарирование. Под препарированием подразумевают подготовку биологического материала для микроскопического исследования

Для большинства работ подходящая толщина биологического материала составляет несколько микрон, что меньше диаметра большинства клеток животных и растений, но больше, чем размер многих органелл. Если препараты слишком толстые, избыток деталей может затруднить анализ, если слишком тонкие - то контраст может оказаться недостаточным, и соотношение различных компонентов останется неясным.

Большинство живых клеток легко повреждаются, и попытка непосредственно получить с них тонкие срезы приведет к полному нарушению их морфологии. Таким образом, почти все биологические объекты можно исследовать только после проведения определенных стабилизирующих процедур, называемых фиксацией. Такая стабилизация должна не только защищать объект от механического повреждения, но и препятствовать автолизу, заражению микроорганизмами, экстракции и осмотическому повреждению в растворителях, которые используются в процессе приготовления препаратов.

В результате фиксации, растворимые нативные компоненты клеток и тканей превращаются в нерастворимые производные. Во всех случаях при фиксации имеет место один или несколько из четырех процессов.

1. Денатурация белков — если ее не произойдет, то большинство клеток растворится в процессе приготовления или окрашивания препарата.

2. Поперечное «сшивание» внутриклеточного содержимого, например белков глутаровым альдегидом или ненасыщенных липидов четырехокисью осмия.

3. Образование нерастворимых комплексов, например между внутриклеточными катионами меди и анионами сульфида.

4. Вещества, которые не изменяются при фиксации, могут быть стабилизированы с помощью сети, образующейся из фиксированных белков или липидов.

Таким образом, стабилизация содержимого препарата достигается применением такой фиксирующей смеси, которая делает нерастворимыми интересующие нас компоненты. Сохранение морфологии зависит в первую очередь от стабилизации белков. Однако возможности фиксации в определенной степени ограничены. Разумеется, не все вещества можно сохранить в препарате. Например, трудно сохранить в нем насыщенные липиды, низкомолекулярные водорастворимые компоненты, такие как аминокислоты или сахара. Другая проблема возникает из-за избыточности фиксации. Ярким примером этого может служить выявление ферментативной активности. Многие белки плохо сохраняются в клетках, если они не денатурированы и не сшиты поперечными связями, но в результате подобной модификации структуры часто подавляется их ферментативная активность.

Цель фиксации – сохранить структуру ткани в состоянии, наиболее близком к прижизненному. При этом фиксация останавливает идущие в тканях метаболические процессы, препятствует посмертным изменениям, стабилизирует пространственное положение различных компонентов клетки, которое они занимали при жизни в момент предшествующий фиксации.

В зависимости от способа прекращения метаболических процессов различают химическую и физическую фиксацию. Физическая фиксация осуществляется в процессе замораживания или теплового воздействия (с помощью микроволнового излучения), но наиболее широко используется фиксация химическими веществами.

Химические фиксаторы

Фиксатор – это, как правило, смесь фиксирующих веществ и других компонентов, которые определяют величину рН, ионный состав, ионную силу и осмотическое давление фиксирующего раствора.

Фиксирующие вещества можно условно разделить на две группы:

1. обезвоживающие (происходит денатурация белка за счет «разрушения» гидратных оболочек белковой молекулы):

Метиловый спирт (метанол). СН₃ОН (М.м. 32). Бесцветная прозрачная жидкость со слабым спиртовым запахом. Температура кипения 64,7 °С. Горит голубоватым пламенем. Смешивается с водой, этиловым спиртом, диэтиловым эфиром и большинством органических растворителей. Сильно действует на нервную и сосудистую системы. Смертельная доза при попадании во внутрь – 30 г; 5-10 г метанола вызывает тяжелое отравление, сопровождающееся слепотой.

Применение. В гематологической, цитологической и цитохимической практике в качестве фиксатора, особенно при изучении цитохимии ДНК, РНК, гистидина, сульфгидрильных групп, некоторых ферментов; в гистохимии в смеси с хлороформом для выявления липидов методом экстракции и в смеси с НСl для блокирования карбоксильных групп.

Этиловый спирт (этанол). С₂Н₅ОН (М. м. 46). Бесцветная прозрачная жидкость с характерным запахом. Температура кипения 78 °С. Горит голубым пламенем. Смешивается с водой, метиловым спиртом, диэтиловым эфиром и большинством органических растворителей.

Положительные свойства спирта как фиксатора: быстро проникает в ткани, быстро и необратимо свертывает белки, незначительно нарушая их строение, хорошо уплотняет материал, который затем хорошо окрашивается большинством красителей, химически нейтральный и относительно индифферентный фиксатор, так как не оказывает заметного воздействия на реакционноспособные группы и потому употребляется при изучении физико-химического состояния клеток.

Недостатки спирта как фиксатора: у нежных объектов (например, у меристематических клеток) он не только сжимает содержимое клетки, но и деформирует оболочку, делает материал ломким, растворяет и экстрагирует жиры и липоиды. Недопустимо включение спирта в качестве компонента в фиксирующие смеси для аппарата Гольджи и митохондрий.

В чистом виде как фиксатор в цитологии и гистологии не используется.

Уксусная кислота. СН₃СООН (М. м. 60). Прозрачная бесцветная едкая жидкость с резким запахом. Гигроскопична. Температура плавления 16,6°С, температура кипения 118,1°С. Смешивается с водой, этиловым спиртом и диэтиловым эфиром. Легко воспламеняется. Горюча, температура вспышки 38 °С. Действует раздражающе на слизистые оболочки, концентрированная кислота вызывает ожоги.

В чистом виде как фиксатор используется редко и только для специальных целей, но входит в состав различных фиксирующих смесей под названием ледяная уксусная кислота (100%-я уксусная кислота, образующая при охлаждении кристаллическую массу). Используют и концентрированную уксусную кислоту, содержащую 4% воды.

Положительные свойства уксусной кислоты как фиксатора: быстро проникает в ткани, хорошо сохраняет форму хромосом, поэтому является обязательным компонентом для смесей, используемых для хромосомного анализа, хорошо осаждает нуклеиновые кислоты и гистоны ядра, но не фиксирует протеины цитоплазмы и, следовательно, увеличивает контраст между ядром и цитоплазмой; после фиксации с уксусной кислотой хроматин ядра хорошо окрашивается основными красителями, поэтому ледяная уксусная кислота входит в состав многих ядерных фиксаторов. Недостатки уксусной кислоты как фиксатора: может вызвать набухание и сморщивание клеток, имеет тенденцию размягчать растительные ткани, растворяет липоиды, разрушает митохондрии и комплекс Гольджи.

В последние годы уксусную кислоту нередко заменяют при фиксации пропионовой кислотой, которая способствует лучшей фиксации и окрашиванию объекта.

Пропионовая кислота. СН₃СН₂СООН (М.м. 74). Прозрачная, бесцветная, подвижная жидкость с резким острым запахом, напоминающим запах уксусной кислоты. Смешивается с водой, растворима в этиловом спирте, диэтиловом эфире, хлороформе и большинстве других органических растворителей. Горюча, температура вспышки 54 °С.

Применяется в гистохимии в качестве компонента фиксатора Ньюкомера для исследования нуклеиновых кислот с сохранением хромосом.

Глицерин (глицерол). НОСН₂—СНОН—СН₂ОН (М. м. 92). Безводный глицерин — прозрачная, бесцветная, густая, вязкая жидкость почти без запаха, сладковатая на вкус. Температура плавления 17,9°С, температура кипения 290 °С (с разложением). Гигроскопичен. Смешивается с водой, метиловым, этиловым, пропиловым, изопропиловым спиртами, этилен- и пропиленгликолями, фенолом, практически нерастворим в диэтиловом эфире, высших спиртах, жирных маслах, углеводородах и хлоруглеводородах.

Применяется в качестве растворителя, осветлителя, смягчающего и консервирующего средства, а также составного компонента сред для заливки и заключения объектов.

2. химически активные вещества, которые в процессе фиксации реагируют с химическими компонентами клетки, и тем самых их стабилизируют.

Альдегиды. Характерной способностью альдегидов является то, что их карбонильные группы способны вступать во взаимодействие с функциональными группами белков, содержащими реакционно-способный водород: амин-ными, иминными, гидроксильными, карбоксильными, сульфгидрильными, дисульфидными, гуанидиновыми и др. По Френчу и Эдсону [1] эта реакция с формальдегидом проходит в две стадии: 1) присоединение формальдегида к соединению, содержащему реакционно-способный водород, с образованием гидроксиметильного производного и 2) конденсация этого производного с другой молекулой RH с образованием метиленового мостика (-СН₂-):

RH+CH₂O  RCH₂—ОН; RCH₂—OH + HR  R—CH₂—R + Н₂О

Конденсация двух молекул с образованием метиленового мостика может происходить как между боковыми, так и между осевыми цепями полипептидов. Образующиеся связи весьма непрочны, легко гидролизуются, чем объясняется большая чувствительность фиксированных формалином объектов к последующим обработкам, например спиртом.

Реакции диальдегидов (например, глутарового альдегида) с молекулами белков более сложны и многочисленны. Сейчас уже нет оснований считать, что в этом случае одна мономерная молекула глутаральдегида просто связывает две белковые цепи. Ричарде и Нолис [44] обнаружили, что в водных растворах глутаральдегид существует в форме мономеров, димеров и даже более сложных полимеров. При этом в растворе содержится также значительное количество ненасыщенных альдегидов, образующихся в результате альдольной конденсации. В процессе фиксации может участвовать любой вид этих молекул, что, возможно, и объясняет высокую связывающую активность глутаральдегидного фиксатора. Ричарде и Нолис [44] предположили, что образующаяся прочная и необратимая межмолекулярная связь, вероятнее всего, возникает в результате реакции с ненасыщенными альдегидами.

Формальдегид (муравьиный альдегид) СН₂О (М. м. 30). Бесцветный горючий газ с резким раздражающим запахом. Легко растворим в воде, спиртах, гликолях и других полярных растворителях, плохо растворим в бензоле, диэтиловом эфире, хлороформе, не растворим в петролейном эфире и других неполярных жидкостях. Формалин (формол) представляет собой раствор формальдегида в воде. Стандартный формалин (продажный) содержит 37—37,3% формальдегида, 6-15% метилового спирта (стабилизатор) и 0,02—0,04% муравьиной кислоты. Бесцветная жидкость с острым запахом. Смешивается с водой, этиловым спиртом, ацетоном. При длительном хранении препарата, особенно на холоду, формальдегид легко полимеризуется в параформальдегид (параформ), представляющий собой смесь полиоксиметиленгликолей, образуя муть, которая постепенно оседает в виде белого осадка.

В микроскопии находит применение как универсальное фиксирующее средство (впервые введенное в микроскопическую практику Ф. Блюмом в 1890 году). В отличие от других фиксаторов хорошо сохраняет форму, окраску и структуру препарата, не вызывает резкого сжатия тканей, а фиксированный материал хорошо режется и подвергается дальнейшей обработке. Формалин в значительной степени стабилизирует жиры и липоиды. Наличие в формалине примеси муравьиной кислоты отрицательно сказывается на процессе фиксации. Во избежание этого формалин нейтрализуют карбонатом кальция или магния (100 г на 1000 мл формалина).

Глутаровый альдегид (глутаровый диальдегид, глутаральдегид)

М. м. 100

Бесцветная прозрачная жидкость. Легко растворим в воде, диэтиловом эфире и других органических растворителях. Нестоек, при хранении полимеризуется. При перегонке под вакуумом вновь образуется мономерная форма.

Раздражающе действует на кожу, слизистые оболочки глаз и верхних дыхательных путей. Применяется в качестве фиксатора тканей в гистологии и гистохимии и, особенно, в электронной микроскопии. Сшивающий агент при работе с белками.

Уксусный альдегид (ацетальдегид). СН₃СНО (М.м. 44). Бесцветная подвижная горючая жидкость с резким удушливым запахом (порог восприятия около 0,0001 мг/л). Температура плавления -124 °С, температура кипения 20,8 °С. Плотность 0,783 г/см³. Смешивается с водой, этиловым спиртом, диэтиловым эфиром. Под действием влаги и воздуха окисляется в уксусную кислоту. В присутствии неорганических кислот легко полимеризуется в жидкий паральдегид или кристаллический метальдегид.

В гистохимии ферментов применяется в качестве фиксатора (10%-ный раствор в фосфатном или какодилатном буферном растворе).

Кротоновый альдегид. СН₃—СН=СН—СНО (М. м. 70).

Известен в виде цис- и транс-изомеров, продажный кротоновый альдегид — транс-изомер. Бесцветная или желтоватая прозрачная жидкость с резким запахом. Температура плавления —69 °С, температура кипения 102,2 °С. Плотность 0,848 г/см3. Легко растворим в этиловом спирте, диэтиловом эфире и других органических растворителях. В 100 г воды при 20 °С растворяется 18,1 г альдегида, в 100 г кретонового альдегида растворяется 9,5 г воды. С водой образует азеотроп (24,3% Н₂О) с температурой кипения 84 °С.

Наличие в молекуле альдегидной группы и двойной связи обусловливает его чрезвычайную реакционную способность, в частности реактив склонен к полимеризации и медленно окисляется на воздухе.

Токсичен. Сильно раздражает конъюнктивиту глаз и верхние дыхательные пути. При попадании на кожу вызывает местную воспалительную реакцию с последующим изъязвлением верхнего слоя кожи. Горюч. Взрывоопасная концентрация паров в воздухе 2,95—15,5% (об.).

Применяется в обычной и электронной микроскопии в качество фиксатора.

Хранение. В прохладном месте склада ЛВЖ. На банке с реактивом должна быть наклеена этикетка с надписью «Токсичен». «Огнеопасен».

***

По своей способности сохранять тонкие клеточные структуры глутаральдегид превосходит все другие альдегиды и является наиболее употребительным фиксатором.

Формальдегид менее эффективен при фиксации белков, чем глутаральдегид, однако его часто применяют в тех случаях, когда особенно важно сохранить активность ферментов в тканях. Карновский [31], Фрэнд и Фаркер [24] рекомендовали использовать смесь глутаральдегида и формальдегида; при этом они исходили из того, что быстро проникающий в ткань формальдегид остановит посмертные изменения, а проникший позднее глутаральдегид завершит формирование межмолекулярных связей.

Качество фиксации в значительной степени зависит от чистоты применяемых альдегидов.

Оксид осмия (VIII) («осмиевая кислота»; осмия тетроксид, четырехокись осмия).

OsO₄ M. м. 254

Блестящие, бесцветные кристаллы или слегка желтовато-зеленоватый игольчатый монолит, заметно расплывающийся при комнатной температуре. Светочувствителен и гигроскопичен. Температура плавления 40,6 °С, температура кипения 131,2°С. В горячей воде плавится в виде маслянистых капель и постепенно растворяется в ней, образуя нейтральные растворы. Растворим в этиловом спирте, бензоле и диэтиловом эфире. Легко разлагается на воздухе и летуч уже при комнатной температуре (в продажу поступает в запаянных стеклянных ампулах).

Сильный окислитель. Очень легко восстанавливается органическими веществами. Четырехокись осмия взаимодействует с липидами по месту двойных связей. Полагают, что поперечные связи между соседними молекулами формируются следующим образом:

Существует предположение, что четырехокись осмия, прореагировав по месту двойных связей липидов, реагирует затем с их полярными группами [45].

Что касается взаимодействия OsO₄ с белками, то в этом вопросе ясности нет. По-видимому, OsO₄ способствует образованию поперечных связей между молекулами белков [26]. Высказывается предположение о взаимодействии между SH- и SS-группами [9, 10], а также о взаимодействии между аминогруппами боковых цепей [47].

Нуклеиновые кислоты и углеводы, вероятно, не взаимодействуют с четырехокисыо осмия. Однако если нуклеиновые кислоты связаны с белками, как, например, в рибосомах или в хромосомах, то они удерживаются при фиксации белковой части комплекса. Малорастворимые частицы агрегированного гликогена обычно удерживаются в ткани молекулярной сетью фиксированных белков. Небольшие растворимые молекулы, как правило, не сохраняются.

В микроскопии применяется в качестве фиксатора. Из всех известных до настоящего времени фиксирующих агентов тетроксид осмия лучше всего сохраняет структуру клетки без сжатия и в состоянии, наиболее сходном с прижизненным; недостаток его — малая диффузионная способность.

Используется в гистохимии для выявления липидов и дегенерирующего миелина, в электронной микроскопии в качестве фиксатора и для дополнительного окрашивания с целью контрастирования исследуемых липидных компоненттов.

Ядовит. Уже в малых концентрациях пары реактива вызывают боль в глазах, слезотечение, конъюнктивит, раздражение верхних дыхательных путей и бронхит. Длительное воздействие малых концентраций вызывает поражение роговицы, даже слепоту, а также воспалительные заболевания кожи, которые могут привести к омертвлению значительных ее участков.

При работе с тетроксидом осмия следует соблюдать особую осторожность, избегать попадания паров осмия в дыхательные пути и особенно в глаза. Рекомендуется разбивать ампулу под водой в том сосуде, который будет использован для хранения приготовленного рабочего раствора. Во избежание загрязнения реактива, прежде чем разбить ампулу, с нее следует снять этикетку и тщательно отмыть клей. OsO₄ растворяется медленно, поэтому растворы следует готовить не менее чем за сутки до их использования [9].

Оксид хрома (VI) (хрома триоксид; хромовый ангидрид). СrО₃ (М.м. 100)

Темные коричнево-красные в виде игл или призм кристаллы, расплывающиеся на воздухе. Легко растворим в воде (1:1,6 при 20°С) с образованием хромовой кислоты. Сильный окислитель, некоторые органические вещества при соприкосновении с ним вспыхивают. Механизм фиксации схож с OsO_4.

Токсичен, действует на слизистые оболочки дыхательных путей и кожные покровы.

В микроскопии применяется в качестве фиксатора как в чистом виде (хромовая кислота), так и в смеси с другими фиксирующими агентами.

Ртуть двухлористая (ртуть хлорная; ртути (II) хлорид; сулема). HgCl₂ (M.м. 271,5).

Бесцветные кристаллы ромбической системы, белые прозрачные кристаллические кусочки или кристаллический порошок. Температура плавления 277 ^оС, температура кипения 302 °С. Плотность 5,44 г/см³. Растворима в воде (1:15 при 20°С), в кипящей воде (1:2) и в 95%-ном этиловом спирте (1:3).

Сильнодействующий яд. Поражает центральную нервную систему, печень, почки, желудок, кишечник. Вызывает набухание и кровоточение десен, стоматит, набухание лимфатических и слюнных желез. ПДК 0,0001 мг/л; смертельная доза 0,2—0,5 г.

Фиксирующее действие двухлористой ртути основано на способности иона ртути (Hg²⁺) реагировать с карбоксильными и гидроксильными группами белков, фосфорнокислыми остатками нуклеопротеидов, на его избирательном сродстве к SH-группе. В чистом виде сулема используется редко, чаще входит в фиксирующие смеси с солями хрома, уксусной кислотой, формалином, трихлоруксусной кислотой и др.

Калий двухромовокислый (Калия бихромат; Kalium pyrochromat). К₂Сr₂О₇ (М. м. 294)

Оранжевые кристаллы триклинной системы. Плотность 2,69 г/см³. Растворим в воде (1:21 при 0 °С, 1:8 при 20 °С, 1:1 при 100 °С), практически не растворим в этиловом спирте. Водный раствор показывает слабокислую реакцию. Сильный окислитель.

Ядовит. Действует раздражающе и прижигающе на слизистые оболочки и кожу, вызывая изъязвления, поражает желудочно-кишечный тракт. ПДК 0,01 мг/м³ (в пересчете на СrО₃).

Применяется в микроскопии в качестве окислителя и фиксатора. Входит в состав многих фиксирующих смесей: фиксатора Альтмана, смеси Мюллера, фиксатора Элфтмана, жидкости Рего, жидкости Ценкера, жидкости Чиаччио, смеси Орта и др.

Калий марганцевокислый (Калия перманганат). KMnO₄ (M. м. 158)

Темно-фиолетовые, почти черные кристаллы с сине-стальным блеском. Имеют сладковато-вяжущий вкус. Растворим в холодной воде (1:16 при 20°С), легко растворим в кипящей воде (1:3). Водный раствор имеет нейтральную реакцию. Сильный окислитель. В смеси с горючими веществами воспламеняется, горючие вещества, в свою очередь, при контакте с сухим перманганатом калия способны загораться, часто со взрывом.

Применяется в микроскопии в качестве окислителя для отбеливания срезов, для перевода гематоксилина в гематеин, для образования альдегидных групп в полисахаридной цепи и т. п.; в гистохимии для выявления меламина методом обесцвечивания и как ингибитор щелочной фосфатазы.

В электронной микроскопии в качестве фиксатора и контрастирующего средства при исследовании клеточных мембран. При фиксации липо-протеидных комплексов в мембранных системах клетки по Люфту, почти все компоненты клетки при этой фиксации разрушаются, а клеточные мембраны выявляются в виде очень тонких темных линий на бледном фоне; гранулы гликогена хорошо сохраняющиеся при этой фиксации, могут быть также выявлены, но после дополнительного окрашивания гидроксидом свинца.

Пикриновая кислота (2,4,6-Тринитрофенол)

C₆H₃N₃0₇ (M. м. 229)

Светло-желтые блестящие мелкие кристаллы без запаха, сильно горького вкуса. Температура плавления 122,5 °С. Плотность 1,767 г/см³. Мало растворима в холодной воде (1:70 при 20 °С), хлороформе (1:50) и диэтиловом эфире, растворима в кипящей воде (1:15), легко растворима в этиловом спирте и бензоле. Взрывает при ударе или нагревании свыше 300 °С. Водные растворы и увлажненная пикриновая кислота (не менее 40% воды) не взрывоопасны. Токсична.

Применяется в микроскопии в качестве фиксатора и красителя. В чистом виде для фиксации применяется редко, чаще в смеси с другими веществами: формалином, ледяной уксусной кислотой, сулемой, азотной кислотой и др.

Хранить плотно укупоренной, в прохладном и огнебезопасном месте. На банке с реактивом должна быть наклеена этикетка с надписью «Взрывоопасна!».

Буферные системы

Важнейшее значение для качественной фиксации имеет состав буферных растворов, используемых для приготовления фиксаторов.

Буферные растворы фиксаторов должны отвечать следующим требованиям: 1) обеспечивать сохранение рН в пределах от 5,0 до 8,0

2) иметь низкую ионную силу;

3) характеризоваться отсутствием субстанций, реагирующих с компонентами фиксатора;

4) величина диссоциации не должна зависеть от концентрации;

5) устойчивость к оксидации, стабильность;

6) дешевизна и легкость приготовления.

Если во время фиксации живой ткани не используются буферные растворы, то рН фиксирующего раствора быстро падает. Применение буферных систем, которые поддерживают рН на уровне физиологических значений (7,0-7,5 для большинства тканей млекопитающих, и 6,0-7,0 для растительных), существенно снижает повреждающее действие фиксации.

При фиксации в альдегидах и дофиксации в четырехокиси осмия растворы лучше приготавливать на одном и том же буферном растворе с одинаковыми значениями рН и молярности, а при исследовании клеточных культур фиксатор желательно готовить на культуральной среде. Составляющие буфера для фиксатора рекомендуется готовить непосредственно перед применением. В микроскопии чаще всего используются фосфатные буферы, а также S-коллидиновый, трис-малеатный и какодилатный буферные растворы. Фосфатные буферы (ФБ) принято считать «физиологическими буферами», поскольку их составляющие содержатся в живых организмах. Они стабильно поддерживают рН на уровне от 6,0 до 7,5 и обладают высокой буферной емкостью, но плохо держит рН выше 7,5. Недостатком ФБ является и то, что при их использовании (особенно при цито- и гистохимических методиках) иногда образуются осадки. Кроме того, фосфатный буфер в процессе хранения часто зарастает микроорганизмами и грибами. Поэтому после приготовления ФБ желательно отфильтровать, прокипятить и хранить при t = 4 °С. Такой буфер сохраняет рН в течение 1-2 недель. Смесь К и Na фосфатов более устойчива, чем смесь одних натриевых солей или калиевых.

Прописи приготовления фосфатных буферных систем описаны в приложении 1.

Какодилатный буфер пригоден как для осмиевых, так и для альдегидных фиксаторов. Какодилатный буфер легко готовить, он стабилен при хранении, эффективен в интервале значений рН от 6,4 до 7,4, широко используется в гистохимии, поскольку удаляет из тканей ионы фосфата, не зарастает грибами, так как содержит мышьяк, оказывает сильное токсическое влияние (осторожно!) на живые клетки

Коллидиновый буфер (используют только очищенный S-коллидин) позволяет не применять осмотические добавки, стабилен даже при комнатной температуре, не меняет рН в течение года, способствует проникновению фиксатора в ткани и не зарастает бактериями и грибами в течение длительного времени. Однако он токсичен и имеет неприятный запах. Коллидиновый буфер эффективен в интервале рН от 6 до 8. Он способствует экстрагированию фосфолипидов и протеинов.

Веронал-ацетатный буфер широко применялся ранее. Он оказался непригодным для альдегидных фиксаторов, поскольку реакция, происходящая между фиксатором и буфером, лишает последний буферных свойств. Как веронал-ацетатный буфер, так и Трис-буфер вступают в химическую реакцию с альдегидами. Веронал-ацетатный буфер плохо растворим в воде, и поэтому концентрированные растворы приготовить сложно. Необходимы осмотические добавки. Веронал-ацетатный буфер эффективен в интервале рН от 4.2 до 5.2.

Буферы на базе сложных органических веществ, называемых ТРИС, ГЕПЕС и ПИПЕС, применяют в микроскопии реже, в основном в тех случаях, когда требуется длительная фиксация материала. Органические буферы могут реагировать с четырехокисью осмия. Они несколько уменышают экстракцию компонентов клеток. ПИПЕС используют, если важно сохранить липиды мембран. Трис-буфер плохо удерживает рН ниже 7.5 и вступает в реакцию с альдегидами. При повышении температуры его рН, как правило, снижается, однако повышение концентрации буфера увеличивает буферную емкость системы и предупреждает падение рН.

Осмотическое давление

Большое значение для сохранности тканей и клеток имеет осмо-лярность фиксатора. При неправильном подборе осмолярности появляется множество артефактов: клетки и клеточные органеллы сморщиваются (если раствор гипертонический) или набухают (если раствор гипотонический).

Концентрация ионов в растворе равна молярной концентрации растворенного вещества, умноженной на число частиц, образующихся при диссоциации каждой молекулы, и пропорциональна осмотическому давлению. Однако эта зависимость не является линейной. В растворе молекулы и ионы взаимодействуют друг с другом. С другой стороны, осмотическое давление раствора, содержащего белки и соли, сильно отличается от осмотических свойств раствора, содержащего только электролиты. Осмотическое давление плазмы крови составляет приблизительно 0,3 Осм. Это давление является изотоническим (т. е. в нем клетки не меняют свой объем). Таким же действием обладает 0,16 М (0,9 %-ный) раствор NaCl.

Общая осмолярность фиксатора включает осмолярность буфера и фиксирующего вещества. Чаще всего наилучшие результаты дает слегка гипер-осмолярный фиксатор. Для большинства тканей осмолярность буферных растворов может варьировать от 0,05 до 0,2 Осм.

Наиболее чувствительными органоидами к осмолярности являются митохондрии: они «чувствуют» изменения в 20 мОсм. В нативных условиях клеточная мембрана обладает свойством избирательной проницаемости для различных ионов. В процессе фиксации осмолярность фиксатора в тканях меняется: фиксатор может разводиться внутриклеточной жидкостью. В некоторых тканях, например в почке, имеются клетки с разной осмолярностью.

Осмолярность не зависит от температуры. Если растворы не диссоциируют, то молярность равна осмолярности. Из-за того, что диссоциирующие на ионы вещества могут взаимодействовать, их осмолярность меньше, чем расчетная. Следовательно, растворы одинаковой молярности могут иметь разную осмолярность. Нежелательно, чтобы общая осмолярность фиксатора не превышала 500 мОсм, а растворителя 300 мОсм. Для лучшей сохранности клеточных структур к фиксаторам, особенно содержащим формальдегид и четырехокись осмия, рекомендуется добавлять сахарозу или глюкозу. Сахарозу (~3-6 %) и глюкозу (~4 %) следует растворять непосредственно перед употреблением. 0,5 М сахароза имеет осмолярность 670 мОсм. К этим цифрам следует добавить величину осмолярности среды, в которой растворен фиксатор.

Добавление к фиксатору NaCl ухудшает качество фиксации, так как в раствор вносятся свободно перемещающиеся ионы, несущие электрический заряд. Добавление сульфата аммония и KH₂PO₄ к фиксатору стабилизирует нативную конформацию протеинов. При добавлении к фиксатору CaCl₂ (например, 10 ммоль/л) наблюдается: 1) уменьшение набухания клеточных компонентов; 2) улучшение сохранности клеточной формы; 3) уменьшение экстракции клеточного материала; 4) стабилизация мембран. В то же время, поскольку СаСl₂ стимулирует секрецию и сокращение гладко-мышечных клеток, в некоторых случаях его заменяют на MgCl₂. Кроме того, MgCl₂ не вызывает преципитации протеинов. Сахароза и поливинилпирролидон ингибируют активность некоторых ферментов.

Лучше всего использовать растворитель с осмолярностью 295—310 мОсм/л. В случае использования альдегидов наилучшие результаты получены именно при осмолярности фиксатора около 300 мОсм. Изменения концентрации глутаральдегида от 2 до 5 % не оказывают заметного воздействия на структуру интактной ткани, особенно в присутствии оптимального по осмолярности растворителя. Считается, что молекулы самих фиксаторов не оказывают существенного влияния на осмолярность фиксирующих тканей. Поэтому варьируют составом буферных растворов. Однако это справедливо в основном для глутаральдегида, который быстро связывается с реакционно-способными группировками в тканях. Формальдегид не обладает такой афинностью как глутаральдегид, и может на начальных этапах фиксации вносить вклад в осмолярность фиксатора.

Точно сказать, какое влияние на клетки и ткани оказывают различные компоненты фиксатора, невозможно. Поэтому чаще всего осмолярность подбирается опытным путем.

Спиртовые фиксирующие смеси