2.5. Глубина резкости изображения
Глубина резкости изображения (глубина фокуса) - способность объектива одновременно давать резкие изображения точек, находящихся от него на разном расстоянии, или глубина препарата, видимая одновременно резко. Она зависит от увеличения микроскопа и апертуры объектива. Каждый объектив позволяет видеть препарат на определенную глубину в одной плоскости. На большом увеличении необходимо поочередно фокусировать объектив в разных плоскостях. На малых увеличениях и малой апертуре глубина резкости больше, чем при больших увеличениях. Показатель глубины резкости следует особенно учитывать при микрофотографии, когда необходимо четко видеть изображение объекта в одной плоскости зрения. Глубина резкости – это глубина препарата, видимая одновременно резко. Её определяют по формуле:
T = (1000/7A×V)+(λ/2A2) (1.5)
При небольших увеличениях и малой апертуре глубина резкости больше, чем при больших увеличениях и высокой апертуре.
Качество микроскопа определяется не увеличением, а разрешающей способностью оптических устройств.
В случае сухих объективов (без использования жидких сред - иммерсии) коэффициент преломления равен единице (п = 1) и NA < 0,95.
Иммерсионная система - объектив микроскопа, у которого пространство между фронтальной линзой и рассматриваемым предметом заполнено жидкостью с более высоким показателем преломления, чем воздух. Для иммерсионных объективов нумерическая апертура зависит от показателя преломления жидкости, находящейся между препаратом и объективом. Поэтому для водноиммерсионных объективов NA меньше либо 1,25 (вода имеет n = 1,33), а для масляно - иммерсионных объективов NA меньше либо равно 1,4 (кедровое масло имеет n = 1,515). На рисунке 3 представлен ход лучей при использовании масляной иммерсии и сухого объектива. Как видно из этого рисунка, в сухой системе некоторая часть лучей не попадает в объектив, так как при выходе из покровного стекла, они отклоняются. Лучи, которые в месте выхода к поверхности стекла образуют угол больше 41о (предельный угол), полностью отражаются. Для стекла и воды предельный угол равен 41°, для кедрового масла и стекла, он не существует по причине равенства показателей их преломления. Для улучшения качества изображения часто применяется полная иммерсия, когда иммерсионную жидкость наносят и на конденсор.
Рис. 3. Сравнение хода лучей при использовании сухого (слева) и иммерсионного масляного (справа) объективов.
При работе с иммерсионными объективами следует соблюдать осторожность, чтобы при опускании тубуса не повредить линзу.
Иммерсионную жидкость наносят между линзой и объективом в виде капли на поверхность покровного стекла препарата и, опуская затем тубус, погружают линзу в каплю иммерсии. Иммерсионную жидкость можно нанести и на поверхность линзы объектива либо по капле и на препарат, и на объектив. Главное требование — создание иммерсии без пузырьков воздуха.
Только в случае соответствия апертур коллектора осветителя, конденсора и объектива разрешающая способность оптики микроскопа используется полностью.