Как мутации распределены по участку-мишени?
Нам известно, что соматические мутации локализованы в короткой ограниченной области ДНК В-клетки. Экспериментальные данные суммированы на рис. 5.5, где показаны перестроенный VDJ-ген тяжелой цепи в начале реакции в центре размножения и та же последовательность через семь и четырнадцать дней. Обратите внимание, что доля мутаций, по-видимому, увеличивается со временем, и что мутации ограничены ближайшим окружением перестроенного VDJ-гена и некодирующими фланкирующими (расположенными по краям) ДНК-последовательностями. Их не находят около промоторного сай-та, с которым связывается РНК-полимеразный ферментный комплекс и с которого начинается (инициируется) копирование мРНК по матрице ДНК (в кэп-сайте, обозначенном на рисунке маленькой витой стрелкой выше лидерного L-кодирующего участка). Не обнаруживаются они и за участком, который, по нашим предположениям, является «локус-специфичным устройством» (Ei/MAR, intronic Enhancer/Matrix Attachment Region).
В самом VDJ-кодирующем участке мутации, обнаруженные в коллекции последовательностей антител высокой аффинности, распределены не случайно, они демонстрируют «структуру Ву-Кэбота». Таким образом, точковые мутации, которые приводят к замене аминокислоты, накапливаются в гипервариабельных участках (или тех областях белка, которые формируют антигенсвязывающий центр). «Молчащие» точковые мутации (те изменения внутри кодона, которые не приводят к замене аминокислоты, см. приложение) накапливаются в консервативных каркасных участках. Наблюдаемые структуры Ву—Кэ-бота (рис. 5.3) означают, что мутантные антитела подвергаются антигенсвязывающему отбору.
Рис. 5.5. Схема, показывающая, что перестроенный V(D)J-reH и соседние фланкирующие участки ДНК служат мишенью для мутатора.
Изображена тяжелая цепь человека или мыши. Картина мутаций для главного семейства легких цепей (капла-цепей) у человека и мыши одинакова. На рисунке показано, что среди У(0)и-последовательностей, выделенных в позднем иммунном ответе (15 дней после воздействия антигена), выявляется большая доля соматических мутаций. Обратите внимание, что соматические точковые мутации расположены в участке, начинающемся недалеко от точки начала синтеза мРНК (транскрипции) и заканчивающемся в районе J-C-интрона около Ei/MAR. Также обратите внимание, что районы промотора (Р) выше VDJ и ниже константной (С) области не мутируют. Предполагается, что Ei/MAR является локус-спе-цифическим устройством, с которым стыкуется мутаторная машина; Х — точковая мутация, кэп — начало синтеза мРНК; т. п. н.— тысяч пар нуклеотидов. Участки, кодирующие белок, показаны прямоугольниками. Дополнительная информация в табл. 5.1 и на рис. 2.6, 4.5 и 5.1.
Такое распределение иллюстрирует две ключевые черты соматического гипермутирования. Разделение ДНК-последовательностей, кодирующих вариабельные (V) и константные (С) области, дает то эволюционное преимущество, что разрешаются мутации в V-генах, но сохраняются неизменными С-гены. То, что механизм соматического мутирования ограничен только перестроенным V(D)J-геном и не затрагивает гена С-области, особенно важно для тяжелых цепей. Они образуют ту часть молекулы антитела, которая определяет ее функциональные свойства, такие как лизис бактериальных клеток, поглощение и разрушение инфекционных агентов фагоцитами, сигналы В-клеткам к делению и продукции антител, процессы, приводящие к стимуляции Т-клеточной помощи В-клеткам. Для легких цепей этого не требуется, потому что константная область легкой цепи не выполняет этих функций.
Второй принцип, показанный на рис. 5.5, — мутации не распространяются вверх от гена. 5'-граница находится вблизи сайта начала транскрипции или лидерного интрона (некодирующая последовательность между L- и V-кодирующими участками, рис. 4.5). Тому есть очень важная причина, так как в этом участке находятся регуляторные последовательности (промоторный, или Р-район), которые определяют связывание РНК-полимеразного комплекса, инициацию транскрипции и образование мРНК.
Важно отметить, что мутации сосредоточены только там, где они не изменяют ни С-областей, ни Р-районов, которые контролируют экспрессию гена. Как достигается такое точное прицеливание?