2.3.4 Посадка эксплантов

Для посадки эксплантов растений использовали стандартную среду Мурасиге и Скуга, только с различной концентрацией углеводов и регуляторов роста.

После того как приготовили среду с заданными концентрациями, ее разливали по пробиркам и баночкам, а затем автоклавировали. Готовую застывшую среду переносили в ламинар-бокс, туда же переносили наши стерильные растения в пробирках, предварительно протерев все пробирки со средой и растениями спиртом. В ламинар-боксе мы извлекали из пробирок стерильные растения (цимбидиум и фиалка), далее переносили их на матрасики и там делили на части. У цимбидиума отделяли одиночные псевдобульбы и переносили по одной в каждую пробирку, иногда брали целые побеги, но только без корней – это в случае посадки на среду с регуляторами роста, чтобы увидеть, как идет процесс корнеобразования. У фиалки отделяли розетки или отдельный черешок с листочком и тоже переносили по одной в каждую пробирку.

Далее баночки и пробирки оставляли на 6 недель в усло­виях постоянного (дневного) освещения и комнатной температуры (23-25^оС).

Для посадки растений в условия ex vitro использовали разную почву.

Для цимбидиума брали специальный грунт, предназначенный для орхидей фирмы «Зри в корень» с добавлением мха и древесной коры. Для фиалок использовали питательный грунт для комнатных растений, фирма «Фаско», содержащий сбалансированный набор питательных веществ, необходимых для полноценного роста и развития растений. Растения, выращенные в условиях in vitro, были заранее от­крыты из ба­ночек для того, чтобы они адаптировались к условиям окружаю­щей среды.

Далее растения цимбидиума и фиалки, были обра­бо­таны ауксином (ИУК) разной концентрации (ИУК 1,0 мг/л, ИУК 0,1 мг/л) и при разных режимах экспозиции – 15 и 30 минут. А часть растений были без об­работки. Также брался во внимание размер самих эксплантов. Длина растений цимбидиума состав­ляла в среднем от 6 до 10 см, а длина фиа­лок от 0,5 до 1,5 см. Посадка осуществлялась в прозрачные, пластиковые сосуды объемом 150 мл., и на одну треть заполненные грунтом.

Перед посадкой почвенный субстрат был обработан 1% раствором KMnO₄. После посадки его еще раз проливали водой и накрывали полиэти­леном для того, чтобы соз­дался микроклимат. Культуральные сосуды остав­ляли на длительное время (4 недели) в ус­ловиях постоянного (дневного) освещения и комнатной температуры (23-25^оС). Высокую влажность в куль­туральных сосудах поддерживали путем однократного в течение суток, оп­рыскивания растений из пульверизатора. При этом осуществлялся и одно­временный полив.

2.3.5 Морфометрические измерения

Измерения проводили ежедневно в течение первых 14 дней и 2 раза в неделю в дальнейшем. При этом учитывали следующие показатели: число жизнеспособных и инфицированных эксплантов, количество розеток, побегообразование, интенсивность их роста.

2.3.6 Повторности и статистическая обработка результатов

Число повторностей в каждом варианте было 5. На графиках представлены средние значение с их стандартными ошибками, рассчитанные по стандартным биометрическим критериямю. Результаты обрабатывали с использованием прикладной программы Stat.

3 Результаты и их обсуждение

3.1 Влияние типа углеродного питания на органогенез Cymbidium hybrids и Saintpaulia ionantha H. Wendl в культуре in vitro

На этом этапе работы нам предстояло выяснить, какая же концентрация того или иного углевода является наиболее оптимальной для роста и дальнейшего культивирования, так как углеродное питание играет важную роль в развитии и образовании новых органов у растений. В эксперименте были использованы 3 углевода в разных концентрациях – глюкоза, фруктоза и сахароза. Глюкоза является моносахаридом, а фруктоза и сахароза дисахариды. Молекула сахарозы состоит из глюкозы и фруктозы, поэтому по своему действию сахароза эквивалентна смеси 50% глюкозы и 50% фруктозы. Глюкоза является продуктом гидролиза большинства дисахаридов.

Итак, в ходе серий опытов мы выясняли, как та или иная концентрация углеводов влияет на ростовые качества и в целом на обменные процессы, происходящие в растении.

В результате данные показали, что варьирование источников углеводного питания оказало существенного влияния на побегообразование и появлению новых розеток у фиалки. Следует отметить, что наибольшую тенденцию к увеличению числа розеток и побегообразования имела посадка эксплантов, культивируемых на сахарозе. А именно для цимбидиума эта концентрация составила 30 г/л, 50 г/л, а для фиалки 40 г/л, 50 г/л, при которой наиболее интенсивно протекали обменные процессы, на что указывает интенсивный рост побегов в течение всего срока эксперимента. Средний прирост побега при таких концентрациях спустя 3 недели составил 14,6 мм, при более высокой концентрации рост замедлялся и составил в среднем 9,7 мм.

Использование глюкозы и фруктозы тоже дало хороший результат, но в процессе органогенеза наблюдалось снижение активности роста, особенно при больших концентрациях. А при малых концентрациях наблюдался нормальный рост, для фиалки это концентрация фруктозы (30 г/л, 40 г/л) и глюкозы (20 г/л, 40 г/л), а для цимбидиума - фруктозы (30 г/л, 40 г/л), глюкозы (40 г/л, 50 г/л). При этих концентрациях средний прирост побега был немного меньше, чем для сахарозы и составил 12 мм

Рисунок 3.1 – Влияние углеводов на длину побегов цимбидиума

а) б)

Рисунок 3.2 – Цимбидиум гибридный на питательной среде МС, с добавлением сахарозы 50 г/л: а) спустя 3 недели; б) спустя 6 недель

Что касается фиалок, то количество розеток, которые образовались при данной концентрации, составило в среднем спустя такое же время 8 шт., а при концентрации больше 50 г/л количество образовавшихся розеток уменьшалось в 1,5 раза.

Рисунок 3.3 – Влияние углеводов на образование розеток у фиалки

Рисунок 3.4 – Фиалка узамбарская на питательной среде МС, с добавлением сахарозы 40 г/л

На основании проведенных исследований можно сделать вывод, что содержание углеводов в питательной среде является важным фактором, влияющим на органогенез эксплантов.