Теоретичні питання

1. Функціональна та біохімічна характеристики системи гемостазу в організмі людини; коагуляційний та судинно-тромбоцитарний гемостаз.

2. Згортальна система крові; характеристика окремих компонентів (факторів) згортання. Механізми активації та функціонування каскадної системи згортання крові; внутрішній та зовнішній шляхи коагуляції. Роль вітаміну К в реакціях коагуляції (карбоксилювання глутамінової кислоти в -карбоксиглутамінову кислоту, роль в зв’язуванні кальцію). Лікарські засоби – агоністи та антагоністи вітаміну К.

3. Спадкові порушення процесу згортання крові.

4. Антизгортальна система крові, функціональна характеристика її компонентів: антикоагулянтів – гепарину, антитромбіну ІІІ, лимонної кислоти, простацикліну. Роль ендотелію судин. Зміни біохімічних показників крові при тривалому введенні гепарину.

5. Фібринолітична система крові: етапи та компоненти фібринолізу. Лікарські засоби, що впливають на процеси фібринолізу. Активатори плазміногену та інгібітори плазміну.

6. Синдром дисемінованого внутрішньосудинного зсідання крові. Зсідання крові, тромбоутворення і фібриноліз при атеросклерозі та гіпертонічній хворобі.

7. Загальна характеристика імунної системи; клітинні та біохімічні компоненти.

8. Імуноглобуліни: структура, біологічні функції, механізми регуляції синтезу імуноглобулінів. Біохімічні характеристики окремих класів імуноглобулінів людини.

9. Медіатори та гормони імунної системи; цитокіни (інтерлейкіни, інтерферони, білково-пептидні фактори регуляції росту та проліферації клітин).

10. Біохімічні компоненти системи комплементу людини; класичний та альтернативний (пропердиновий) механізми активації.

11. Біохімічні механізми імунодефіцитних станів: первинні (спадкові) та вторинні імунодефіцити; синдром набутого імунодефіциту людини.

Практична робота

Дослід 1. Визначення вмісту фібриногену в плазмі крові спектрофотометричним методом (за В.А.Беліцером)

Принцип методу. При додаванні тромбіну в плазму крові утворюється згусток, який підсушують на фільтрувальному папері, а потім розчиняють в ацетатній кислоті. Вміст фібриногену визначають спектрофотометрично.

Матеріальне забезпечення: плазма, фосфатний буфер (0,06 М) з рН 7, 0,15 М розчин натрію хлориду, 0,04 М розчин монойодацетатної кислоти та 1,5 % розчин ацетатної кислоти, тромбін, центрифуга, водяна баня, спектрофотометр.

Хід роботи: У пробірку діаметром 9 – 10 мм заввишки 85 – 90 мм вміщують 0,2 мл плазми крові, додають 1,6 мл 0,06 М фосфатного буфера. Суміш поміщають у водяний термостат при температурі 37 С на кілька хвилин, після чого додають 0,1 мл 0,04 М розчину монойодацетатної кислоти, а через 3 хв додають 0,1 мл тромбіну (якщо препарат тромбіну не містить кальцію, то у пробу перед додаванням тромбіну додають 0,1 мл 0,02 М розчину кальцію хлориду). Після додавання кожного компонента вміст пробірки ретельно перемішують скляною паличкою з шорсткою поверхнею. Паличку залишають у пробірці. Розчин зливають і видаляють згусток, притискаючи паличку до стінок пробірки, повільно помішуючи. Згусток промивають двічі в 0,15 М розчині натрію хлориду, опускаючи паличку кілька разів у кожну з двох склянок з розчином (приблизно по 50 мл). Потім 1 раз промивають в охолодженій дистильованій воді. Рідину для промивання з поверхні згустку видаляють дотиком фільтрувального паперу. Отриманий згусток розчиняють, помішуючи в 5 мл 1,5 % розчину ацетатної кислоти. Розчинення закінчується через 5 хв. Вміст білка в розчині визначають спектрофотометрично, вимірюючи екстинкцію за довжини хвилі 280 і 320 нм. Вміст фібриногену (Х) у досліді розраховують за формулою:

де А (280 – 320) – різниця між значеннями екстинкції за довжини хвилі 280 та 320 нм; 255 – коефіцієнт для вираження в грамах на літр кількості фібриногену під час аналізу 0,2 мл плазми крові; 15,067 – коефіцієнт екстинкції (А₁, 1 см) для фібрину в ацетатній кислоті за довжини хвилі 280 нм.

Приклад розрахунку. Оптична густина, отримана для проби з 0,2 мл плазми крові за довжини хвилі 280 нм, становить 0,216, а за довжини хвилі 320 нм – 0,019. Отже, вміст фібриногену становить:

Зробити висновок, пояснити отримані результати.

Клініко-діагностичне значення. Фібриноген належить до глікопротеїнів, синтезується в печінці та бере участь у процесах згортання крові. В нормі його вміст у плазмі крові коливається в межах 2 – 4 г/л. Підвищення концентрації фібриногену в плазмі крові (фібриногенемію) спостерігають при різноманітних запальних процесах (перитоніті, сепсисі, гепатиті, нефриті, пневмонії тощо). Слід пам’ятати про те, що гіперфібриногенемія не завжди свідчить про гіперкоагуляцію чи схильність до тромбозів. У міру старіння організму вміст фібриногену в крові зростає, що є причиною появи коагуляції.

Гіпофібриногенемія (зниження концентрації фібриногену в плазмі крові) може бути природженою, або виникати внаслідок набутих порушень синтезу фібриногену при хронічному гепатиті, цирозі печінки, травматичному та пост травматичному шоку, тромбогеморагічному синдромі тощо. Зменшення концентрації фібриногену до 1 г/л і нижче може стати фактором ризику виникнення кровотеч із судин внутрішніх органів.

Дослід № 2. Визначення вмісту вільного гепарину в крові за методом сірмаї.

Принцип методу. Метод базується на здатності толуїдинового синього зв’язувати вільний гепарин крові, що призводить до скорочення тромбінового часу.

Матеріальне забезпечення: плазма, 0,1 % розчин толуїдинового синього, розчин тромбіну (25 мг тромбіну на 1 мл 0,85 % розчину натрію хлориду), ізотонічний розчин натрію хлориду, водяна баня, секундомір, відалівські пробірки.

Хід роботи: У відалівську пробірку (контроль) відмірюють 0,05 мл ізотонічного розчину натрію хлориду і 0,1 мл досліджуваної плазми. Пробірку ставлять у водяну баню за температури 37 С. Через 30 с додають 0,1 мл тромбіну і фіксують час згортання крові. В іншу відалівську пробірку (дослід) відмірюють 0,05 мл толуїдинового синього і також ставлять на водяну баню за температури 37С. Через 30 с додають 0,1 мл тромбіну і фіксують час згортання крові. Різниця в часі згортання плазми в першій і другій пробірках свідчить про кількість вільного гепарину.

Зробити висновок.

Клініко-діагностичне значення. Не зважаючи на те, що гепарин синтезується та відкладається про запас в опасистих клітинах, він завжди тісно пов’язаний із кровоносними судинами та виконує низку важливих функцій. Високий негативний заряд гепарину забезпечує його специфічне зв’язування з факторами згортання крові ІХ та ХІ, проте важливішим для його антикоагулянтних властивостей є здатність взаємодіяти з ₂-глікопротеїном плазми – антитромбіном ІІІ, що значно посилює інактивуючу дію антитромбіну ІІІ на серинові протеїнази, а саме на тромбін. Нагромадження в крові білків гострої фази, імунних комплексів призводить до порушення комплексоутворення антитромбін ІІІ-гепарин, тоді як зв’язування гепарину з адреналіном, норадреналіном, серотоніном і гістаміном викликає інактивацію фізіологічних функцій останніх.

гепарин також може специфічно зв’язуватися з ліпопротеїнліпазою, присутньою в стінках капілярів, і викликати вивільнення цього ензиму в кров. Аналогічний процес відбувається з печінковою ліпазою.

У нормі величина вільного гепарину коливається в межах 16 – 20 с. Зменшення кількості гепарину спостерігають при інфаркті міокарда, порушеннях функцій печінки, псоріазі тощо.

Дослід № 3. Визначення циркулюючих імунних комплексів

Принцип методу. Метод ґрунтується на преципітації велико глобулярних імунних комплексів, які циркулюють у крові, високомолекулярним полі етиленгліколем (ПЕГ) з наступним обліком результатів прямим спектрофотометруванням при довжині хвилі 450 нм.

Матеріальне забезпечення: сироватка хворого, 0,1 М боратний буфер (рН 8,4), 4 % розчин поліетиленгліколю-6 000, спектрофотометр, пробірки.

Хід роботи: У контрольну пробірку вносять 2,7 мл 0,1 М боратного буферу (рН 8,4) і 0,3 мл розведеної в три рази боратним буфером сироватки хворого; у дослідну – 0,3 мл розведеної сироватки та 2,7 мл 4 % розчину поліетиленгліколю-6 000 (ПЕГ). Обидві пробірки витримують 1 год при кімнатній температурі, вимірюють екстинкцію на спектрофотометрі при довжині хвилі 450 нм. Отриманий показник екстинкції множать на тисячу і виражають в умовних одиницях.

Зробити висновок.

Клініко-діагностичне значення. Визначення циркулюючих імунних комплексів є важливим тестом для визначення тяжкості та активності патологічного процесу. У нормі їх рівень коливається в межах 30 – 100 ум.од. Розміри ЦІК впливають на їх імунобіологічну активність і роль в патогенезі захворювань. ЦІК великих і середніх розмірів є найбільш патогенними, тобто можуть взаємодіяти з системою комплементу, згортаючою, калікреїнкініновою й іншими регуляторними системами організму і здійснювати цитопатогенний вплив на клітинні мембрани.