Современные технологии тестирования нуклеиновых
кислот
И.А. Новикова
Технологии тестирования нуклеиновых кислот
Это группа методов/технологий, предназначенных для детекции в биологическом образце нуклеиновой кислоты (РНК, ДНК).
Могут выполняться в ручном и автоматизированном форматах .
Автоматизированные форматы ТНК:
Автоматический – автоматизация всех этапов технологии
Полуавтоматический – автоматизация только этапа детекции продуктов реакции
Основная терминология, применяемая в ТНК
Амплификация – копирование
Транскрипция – считывание
Репликация – удвоение
Гибридизация – присоединение
Ампликон – копия мишеневой ДНК, продукты амплификации
Праймеры – синтетические олигонуклеотидные цепочки (20-30 нуклеотидов) со строго заданной последовательностью нуклеотидов, комплемен- тарные определенным участкам на мДНК.
Используются в качестве:
а) затравки для ДНК-полимеразы (синтез ДНК может начаться только с двуспирального участка);
б)выделения нужного участка мДНК (отжиг праймеров).
Основные этапы технологии ТНК
1.Подготовка образца (выделение мишеневой нуклеиновой кислоты)
2.Проведение реакции, направленной на накопление объекта исследования - амплификация
3.Оценка результата - детекция
Оборудование ПЦР-лаборатории
Организация лаборатории для ПЦР и правила работы регламентируются нормативными документами.
Требования к площади: 2 — 3 комнаты общей площадью не менее 60 м2, оснащенных водопроводом и приточно-вытяжной вентиляцией. В случае использования электрофореза для разделения ампликонов три процедуры (подготовка анализируемых проб, амплификация и детекция результатов) должны быть физически изолированы друг от друга для предотвращения контаминации, и проводиться в разных помещениях, оснащенных предбоксами.
Оборудование ПЦР-лаборатории (продолжение)
Минимальный комплект оборудования (при электрофоретической детекции результатов): амплификатор (термоциклер); термостат для термоподготовки проб; настольная центрифуга; центрифуга-вортекс; камера для электрофореза 9х13 см; источник питания для электрофореза; трансиллюминатор («столик с подсветкой») для просмотра гелей, ламинарный бокс.
Подготовка образца для тестирования НК
Наиболее частый материал - клетки крови.
Соблюдать требования к взятию материала
Правильно избрать участок ДНК для каждого аналита, используя высококонсервативные области генома, специфичные для данного организма (опасность ложноположительных результатов)
Соблюдать условия приготовления основных растворов и обработки проб во избежание контаминации
Подходы к накоплению объекта исследования
Технологии амплификации (копирования) мишеневой нуклеиновой кислоты:
1.амплификация матрицы (фрагментов ДНК и РНК): полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее разновидности мультипраймерная ПЦР, лигазная цепная реакция и др.
2.амплификация сигнала (независимый от праймеров): метод гибридизации НК и его модификации, ДНК/ РНК-гибридный захват и др.
Полимеразная цепная реакция
Разработана К. Мюллисом в 1983 г. (Нобелевская премия 1993 г.)
Принцип метода: комплементарное достраивание ДНК-матрицы, осуществляемое in vitro с помощью фермента ДНК- полимеразы. При многократном повторении циклов синтеза происходит экспоненци- альное увеличение количества копий специфического фрагмента ДНК. Многократно копируемый участок ДНК заведомо выбран исследователем и является специфическим, уникальным.
Основные компоненты
реакцииДНК-матрица (ДНК или ее часть,
содержащая искомый специфический фрагмент ДНК в образце любого происхождения);
два синтетических олигонуклеотидных праймера, комплементарные участкам ДНК, на границах определяемого специфического фрагмента и ограничивающих искомую мишенную последовательность ДНК;
четыре дезоксирибонуклеотида — смесь аденозина, цитидина, гуанозина, тимидина, являющихся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК;