Современные технологии тестирования нуклеиновых
кислот
И.А. Новикова
Технологии тестирования нуклеиновых кислот
Это группа методов/технологий, предназначенных для детекции в биологическом образце нуклеиновой кислоты (РНК, ДНК).
Могут выполняться в ручном и автоматизированном форматах .
Автоматизированные форматы ТНК:
Автоматический – автоматизация всех этапов технологии
Полуавтоматический – автоматизация только этапа детекции продуктов реакции и анализа результатов.
Основная терминология,
применяемая в
технологиях
Амплификация – копирование Транскрипция – считывание Репликация – удвоение
Ампликон – копия мишеневой ДНК, продукты амплификации
Праймеры – синтетические олигонуклеотидные цепочки (20-30 нуклеотидов) со строго заданной последовательностью нуклеотидов, комплементарные определенным участкам на мДНК. Используются для: а) затравки для ДНК- полимеразы (синтез ДНК может начаться только с двуспирального участка); б)выделения нужного участка мДНК (отжиг праймеров).
Гибридизация – присоединение
Основные технологические этапы технологии ТНК
1.Подготовка образца (выделение мишеневой нуклеиновой кислоты)
2.Проведение реакции, направленной на накопление объекта исследования - амплификация
3.Оценка результата - детекция
Подходы к накоплению объекта исследования
1.Амплификация (копирование) мишеневой нуклеиновой кислоты:
Репликация мишеневой ДНК (ПЦР)
Транскрипция Мишеневой РНК
Реакция гибридизации мишеневой ДНК или РНК.
Основные этапы проведения ПЦР
Разработана Кэрри Мюллисом в 1983 г. (Нобелевская премия 1993 г. в области химии). Практическое применение с 1985 г.
1.подготовка пробы (2 часа)
1.1.Выделение ДНК из клетки -обработка пробы детергентом (солюбилизация оболочки, денатурация белков)
1.2.Внесение выделенной ДНК в амплификационную пробирку (master mix), содержащую компоненты, необходимые для амплификации: Tag-полимераза, 2 вида праймеров (один комплементарен последовательности нуклеотидов одной из цепей ДНК в начале гена, другой комплементарен второй цепи в конце гена), нуклеотиды, солевой буфер (оптимальный для работы фермента состав).
Tag-полимераза – термостабильная ДНК-зависимая ДНК- полимераза из термофильных бактерий Thermus aquaticus, оптимум работы 70-720С.
Амплификация
В ПЦР это серийные 3-х стадийные температурозависимые циклы (продолжительность 3-5 мин каждый).
Один цикл реакции состоит:
1.Денатурация ДНК (1 мин): плавление ДНК (при 950С) и разъединение цепей ДНК, в результате чего цепочки ДНК становятся доступными для праймеров.
2.Отжиг праймеров с мДНК (1-2 мин). Это присоединение праймеров к мДНК. Происходит при t 600С от 3' конца мДНК по одному праймеру на каждую цепь. Присоединенные праймеры ориентированы в направлении 5' -3', при этом 3' концы обращены друг к другу.
3.Элонгация - синтез двойной спирали ДНК от праймеров в сторону 5' конца на матрице мишеневой ДНК при оптимуме температуры, используя нуклеотидов из master mix под действием фермента Tag-полимераза.
Цель цикла – получить 2 копии заданного гена. Прибор – термоциклер.
Амплификация (продолжение)
После первого цикла амплификации синтез первых двух копий мДНК заканчивается произвольно (праймерами не ограничен), поэтому на обоих их 3' концах образуются «лохмотья», то есть участки нити ДНК различной длины. Со второго цикла амплификации начинают синтезироваться ампликоны.
Ампликоны – короткие, ограниченные по длине с 3' и 5' концов праймерами, продукты амплификации мДНК.
Циклы амплификации повторяются многократно (30- 50 раз), в результате каждого последующего цикла количество ампликонов удваивается и становится достаточным для детекции.
Детекция ампликона
Применение ПЦР в КЛД
Диагностика и мониторинг инфекционных заболеваний
диагностика туберкулеза бактериологические методы – 3-8 недель. ПЦР (ЛЦР) – около 5 часов
диагностика внутриклеточных и мембранных паразитов (вирусы, микоплазмы, риккетсии, хламидии)
– диагностика хламидиоза, папилломатоза, HIV, HCV