Методы фракционирования

биологических жидкостей: электрофорез, хроматография

И. А. Новикова

Хроматография

Хроматография – метод разделения близких по химической структуре веществ, основаный на различном распределении составных частей исходной смеси между двумя фазами – подвижной и неподвижной. Процесс разделения складывается из

многократных (повторяющихся сотни раз) актов

перехода веществ из одной фазы в другую.

Метод разработал Михаил Семёнович Цвет в 1903г., который обнаружил разную сорбируемость пигментов хлорофилла на оксиде алюминия, и как следствие разную скорость продвижения по колонке, заполненной им.

Изначально метод позволял анализировать только окрашенные вещества, что и дало название методу – хроматографией, от греческих слов "хроматос" – окраска, "грамма" – считывание и "графия" – запись.

Основные понятия хроматографии

При хроматографическом разделении компоненты смеси многократно распределяются между двумя несмешивающимися фазами – подвижной и неподвижной.

Подвижная фаза = Элюент – жидкость или газ.

Неподвижная фаза = сорбент – твердое вещество или жидкость.

Вещества, входящие в состав смеси, осаждаются (сорбируются) на сорбенте по-разному: одни – прочнее, другие- слабее. Одни – дольше находятся в связанном состоянии и меньше в растворе; другие – наоборот → смесь постепенно разделяется на составные части. Каждая часть сосредотачивается в своём слое –

образуется хроматограмма. Каждая часть соответствует какому-то одному химическому соединению.

Основные виды хроматографии

В зависимости от природы взаимодействия, обусловливающего распределение компонентов между элюентом и неподвижной фазой,

различают хроматографию:

АдсорбционнаяРаспределительная

Ионообменная

Эксклюзионная (молекулярно-ситовая): гель-проникающая и гель-фильтрация

Осадочная

Виды хроматографии (продолжение)

Адсорбционная хроматография основана на различии сорбируемости разделяемых веществ адсорбентом (твёрдое тело с развитой поверхностью).

Распределительная хроматография основана на разной растворимости компонентов смеси в неподвижной фазе и

элюенте

Ионообменная хроматография основана на различии констант ионообменного равновесия между неподвижной фазой (ионитом) и компонентами разделяемой смеси

Эксклюзионная (молекулярно-ситовая) хроматография

основана на разной проницаемости молекул компонентов в неподвижную фазу (высокопористый неионогенный гель). Гель-проникающая: элюент - неводный растворитель, гель-фильтрация: элюент - вода.

Осадочная хроматография основана на различной способности разделяемых компонентов выпадать в осадок на твёрдой неподвижной фазе.

Виды хроматографии (продолжение)

В зависимости от устройства:

Колоночная – сорбентом заполняют специальные

трубки- колонки, а подвижная фаза движется внутри колонки, благодаря перепаду давления.

Разновидность - капиллярная (тонкий слой сорбента наносится на стенки капиллярной трубки).

Плоскостная – перемещение подвижной фазы

происходит благодаря капиллярным силам. Делится на тонкослойную и бумажную. В тонкослойной хроматографии тонкий слой гранулированного сорбента или пористая плёнка наносится на стеклянную или металлическую пластинки; при бумажной хроматографии используют специальную хроматографическую бумагу.

Приборы для хроматографического анализа

Приборы для хроматографического анализа - хроматографы.

Позволяют производить анализ веществ и препаративное разделение смесей веществ.

Качественный хроматографический анализ - осуществляют по времени выделения детектируемого вещества. При колоночной хроматографии определяют время от момента ввода пробы до выхода каждого компонента из колонки при данной температуре и при использовании определённого элюента. При бумажной хроматографиии - по скорости перемещения пятен веществ относительно скорости растворителя.

Количественный анализ - определяют высоты или площади хроматографических пиков с учётом коэффициентов чувствительности используемого детектирующего устройства к анализируемым веществам (при колоночной) или измеряют интенсивность окраски вещества (при

бумажной).

Сорбенты хроматографического

анализа

Основные параметры сорбента,

имеющие значение для разделения

веществ:

Размеры частиц Качество материала сорбента

Возможность химической модификации сорбента

Влияние размера частиц сорбента

на качество хроматографии

Крупные частицы (30-200 мкм при высоте колонки 1 м) – малая скорость разделения вследствие большой длины диффузии внутри зерен.

Усовершенствование: 1) поверхностно-пористые сорбенты - на неактивное ядро (стеклянный шарик) d 30 мкм наносят тонкий слой сорбента 1-2 мкм. Положительные стороны - небольшое сопротивление потоку. Недостаток - малая сорбционная емкость, так как в значительной степени состоят из неактивного материала.

2) объемно-пористые сорбенты – малый диаметр частиц (3—10 мкм). Достоинство - большая для препаративного разделения веществ). сорбционная емкость (можно использовать Недостаток – значительное сопротивление потоку (необходимость применять давление 50- 400 атм).