Лабораторное обеспечение службы крови

И.А Новикова.

Основные осложнения гемотрансфузионной терапии

1. Сенсибилизация HLA и реакция гистонесовместимости

2. Посттрансфузионная

иммуносупрессия

3. Реакция трансплантат против хозяина

4. Гемо-трансмиссивные инфекции

Обеспечение гистосовместимости донора и реципиента

Иммунологический подбор совместимых пар «донор—реципиент» включает

исследования:

3)антигенов сывороточных белков и антител к ним;

4)комплекс серологических проб на

совместимость между клетками и сывороткой крови исследуемой пары

Антигены HLA

HLA I класса – на мембранах всех ядросодержащих клеток. Экспрессия тканеспецифична. Максимальная экспрессия выявлена на лимфоидной ткани

HLA II класса – преимущественно на АПК и иммунокомпетентных клетках

Результат антигенной несовместимости донора и реципиента по антигенам HLA - сенсибилизация и развитие реакций по типу ГЗТ, рефрактерность к препаратам.

Клинические последствия - посттрансфузионные реакции негемолитического типа. Наиболее часто возникает сенсибилизация к широко распространенным и высокоиммуногенным антигенам: HLA-A2, В5, В35, DR2, DR3, DR5.

Профилактика - использование компонентов крови от гистосовместимых доноров

Анти- HLA –сенсибилизация

1.Естественная - у женщин во время беременности к аллоантигенам плода. Частота аллосенсибилизации при беременности составляет от 5 до 25 %. Специфичность формирующихся антител широкая, чаще анти-В, чем анти-А.

2.При гемотрансфузиях - обусловлена примесью

лимфоцитов, содержащихся в большинстве гемокомпонентов. Пороговая величина иммуногенной нагрузки - 5 млн лимфоцитов. Анти- HLA антитела отмечены, начиная с 6 гемотрансфузий. При 20 гемотрансфузиях около 50% больных сенсибилизированны к HLA. Практически свободны от этой примеси только размороженные

криоконсервированные эритроциты.

Степень аллосенсибилизации зависит от состояния иммунной системы реципиента

Методы подбора

гистосовместимых доноров

1.Фенотипирование лимфоцитов

HLA I класса - с помощью набора гистотипирующих сывороток в микролимфоцитотоксическом тесте. Набор сывороток, определяющих антигены А, В и С локусов системы HLA, должен выявлять не менее 30 наиболее часто встречающихся и редких антигенов системы HLA. Недостаток - недостаточная надежность (доля ошибочных результатов до 20— 25 % ).

HLA II класса - с помощью гомозиготных типирующих клеток в тесте смешанной культуры лимфоцитов.

2.Серологические пробы на индивидуальную совместимость по аллоантигенам лейкоцитов, тромбоцитов и иммуноглобулинов (реакции лейкоцитоагглютинации и тромбоцитоагглютинации в двух вариантах: исследование сыворотки реципиента с клетками крови донора и сыворотки донора с форменными элементами реципиента.

3.HLA-генотипирование с помощью молекулярно-

биологических методо

Этапы проведения лимфоцитотоксического теста

1.Выделение лимфоцитов

Взятие венозной крови, дефибринирование.

Разделение на градиенте плотности фиколла- верографина (1076-1078)

Отмывание полученной взвеси мононуклеаров раствором Хенкса

Приготовление красителя (раствор трипанового синего с эозином)

2.Получение комплемента (используют пул

сывороток кролика, хранение при -196 10-12 месяцев, не размораживая).

Этапы проведения

лимфоцитотоксического теста (продолжение)

1.Постановка реакции: в лунки микрокамеры (типа Терасаки), заполненные вазелиновым маслом (для предотвращения высыхания) вносят в равных объемах стандартные анти-HLA сыворотки и исследуемые лимфоциты, инкубируют при 22°С 30 мин, добавляют комплемент и инкубируют при 22°С 60 мин. Затем добавляют краситель на 3 минуты, стряхивают. Учет непосредственно в лунках при микроскопировании, ув. 10х15. Подсчитывают число погибших (прокрашенных) лимфоцитов.

0— 10% (-) — отрицательная реакция 15— 20% (+) — реакция слабоположительная

20 — 39 % (2+) — реакция положительная

40 — 79 % (3+) — реакция отчетливо положительная

80 — 100 % (4+) — реакция резко положительная

Реакция смешанной культуры

лимфоцитов (СКЛ)

Показания: оценка совместимости донора и реципиента при переливании гемотрансфузионных средств, содержащих значительное количество аллогенных лимфоцитов иммунокомпрометированным реципиентам.

Выявляет детерминанты HLA-D локуса.

Преимущества: позволяет судить о степени совместимости пары донор—реципиент, независимо от количества выявленных антигенов и их принадлежности к главному комплексу гистосовместимости (благодаря тесному сцеплению антигенов локуса D с другими локусами системы HLA).

Основные этапы реакции СКЛ

1. Выделение лимфоцитов

Взятие венозной крови (дефибринирование или с гепарином).

Разделение на градиенте плотности фиколла-верографина (1076- 1078)

Приготовление суспензии мононуклеаров в питательной среде (среда 199, сыворотка эмбрионов коров)

2.Лимфоциты стимулирующей популяции (СП) облучают на Y- облучателе «ИПК» (137Cs) или обрабатывают митомицином С

3.Смешивают отвечающие (ОП) и стимулирующие лимфоциты, инкубируют 5 суток при 37°С в атмосфере 5 % СО2.

4.Удаляют надосадочную жидкость и учитывают результаты:

мазки →фиксация в метаноле 15 мин→ окраска по Романовскому → подсчет бластов. Отрицательный результат – до 15% лимфоцитов с признаками трансформации в бласты.

использование радиационной метки (Н3-тимидин) → измерение радиоактивности проб на β-счетчике. Индекс стимуляции (ИС): величина синтеза ДНК (имп/мин) при стимуляции аллогенными лимфоцитами/величина синтеза ДНК этими же лимфоцитами при

стимуляции аутологичными лимфоцитами