3. Преаналитический этап при микроскопическом исследовании клеток – 15 мин

При использовании того или иного метода микроскопии результаты в значительной степени зависят от соответствующей подготовки объекта исследования: мазка крови, цитологического или гистологического препарата и др.

В процессе приготовления мазка крови на предметном стекле важно равномерно распределить клетки тонким слоем по всей поверхности стекла, без излишнего их повреждения с формированием «щеточной каемки», необходимой длины и толщины, т.е. получить монослойный мазок практически на всем его протяжении.

Существует два типа автоматических устройств для приготовления равномерных мазков крови. В их основе используется механическое распределение клеток или центрифугирование. Цитоцентрифуга концентрирует клетки на небольшой площади, и такие мазки используют для изучения клеток в низких концентрациях, например в спинномозговой жидкости.

В современных гематологических анализаторах есть устройство автоматического приготовления мазков с последующей их фиксацией и окрашиванием, что еще больше сокращает время приготовления препаратов и обеспечивает стандартизацию и постоянство характеристик окраски. Такие анализаторы требуют применения стандартных стекол.

Для изучения морфологии клеток в препаратах — мазках, соскобах, пунктатах, срезах тканей — обычно первоначально проводят их химическую фиксацию с помощью коагулирующих белок веществ: тетраоксида осмия, хромовой кислоты, сулемы, уксусной или пикриновой кислот. Для более быстрой фиксации можно применять лиофилизацию — быстрое замораживание при температуре жидкого азота с последующим высушиванием в вакууме. В практике для фиксации мазков-отпечатков, соскобов используют метанол и этанол, для фиксации срезов тканей — 10 % формалин и лиофилизацию, для препаратов, исследуемых под электронным микроскопом, — глутаровый альдегид (0,5 % и 0,2 % растворы).

В целях повышения контрастности клеточных структур применяют их избирательное окрашивание, основанное на противоположности зарядов красителя и вещества структуры (например, положительно заряженные структуры оксифильны, т.е. окрашиваются кислыми красителями).

4. Цитохимические методы при микроскопии – 12 мин

В основе цитохимических исследований лежит окрашивание специально подобранными красителями, избирательно реагирующими с отдельными химическими компонентами структур клетки. Так, белки выявляют путем обработки препарата реактивами, специфически реагирующими с аминогруппами, сульфгидрильными или дисульфидными группами, либо с отдельными аминокислотами. Для выявления ДНК можно использовать реакцию Фельгена (слабый кислотный гидролиз, отщепление пуриновых оснований, реакция альдегидных групп с фуксиносернистой кис­лотой с развитием красно-фиолетовой окраски). РНК окрашивают основными красителями (азур II, тионин). Окисление полисахаридов йодной кислотой вызывает образование альдегидных групп, реагирующих с фуксиносернистой кислотой (реактив Шиффа или PAS-реакция). Кислые мукополисахариды выявляют с помощью метахромазии, т.е. окрашивания некоторыми основ­ными красителями (например, толуидиновым синим) в цвет, отличный от цвета самого красителя (в данном примере — крас­но-фиолетовый). Липиды окрашиваются жирорастворимыми красителями ( судан красный и черный), отдельные их классы-с помощью специфических красителей.

Неорганические вещества (железо, калий, фосфаты, кальций и др.) можно окрасить известными специфическими для этих ионов реагентами. 0ферменты выявляют путем обработки препаратов субстратами этих ферментов с образованием продуктов реакции, имеющих окраску или поддающихся окрашиванию.

Дальнейшим развитием цито- гистохимического направления явилось использование меченых различными метками антител, направленных против определенных клеточных структур и их отдельных компонентов (иммуноцито- и гистохимия). Для этого направления используют различные варианты методовспецифического связывания и разнообразные хромогены. Иммуногистохимические методы позволяют локализовать и индефицировать клеточные и тканевые антигены, основываясь на их связывании с антителами, использование антител лежит в основе изучения различных образований: структурных компонентов клетки; клеточных продуктов (гормонов, ферментов иммуноглобулинов); рецепторов клеточной поверхности. Для визуализации места связывания антигена с антителом применяют различные метки; металлы; металлопротеины; радиоизотопы.

Несмотря на бурное развитие иммунологии и цитогенетики, {простые цитохимические методы, не требующие сложной и дорогой аппаратуры, основанные на использовании достаточно простого светового микроскопа, хорошо воспроизводимые, инфор­мативные, востребованы во многих лабораториях. Они не утратили своего значения в диагностике различных форм гемобластозов. Особенно оно велико в подтверждении острых миелоидных лейкозов. В настоящее время некоторые производители выпускают готовые наборы реактивов, позволяющие получать хорошо воспроизводимые и правильные результаты.

Цитохимические методы позволяют изучить содержание различных веществ и активность ферментов в клетках крови, костного мозга, лимфатических узлов и других тканей. Применяя их в гематологии в комплексе с морфологической оценкой клеточных элементов, можно выявить направленность дифференцировки кроветворных клеток. Основой идентификации этих клеток служат особенности их метаболизма. В большинстве случаев цитохимическую реакцию оценивают качественно (слабая, умеренная, интенсивная) с указанием процента положительно реагирующих клеток. Существует и полуколичественный метод оценки результатов в условных единицах или с вычислением среднего цитохимического коэффициента (СЦК).