Министерство здравоохранения Республики Беларусь Учреждение образования «Гомельский государственный медицинский университет»

Кафедра клинической лабораторной диагностики

Обсуждено на заседании кафедры

протокол № _________

«___» ______________200_ г.

Лекция

по клинической лабораторной диагностике

для студентов __3_ курса ____медико-диагностического ____ факультета

Тема: Микроскопические методы анализа в лаборатории

Время ___ 2 часа____

Учебные и воспитательные цели:

1. Сформировать представление об современных методах микроскопии в клинико-диагностической лаборатории.

2. Рассмотреть принципы, методические и аналитические особенности микроскопических методов анализа.

3. Ознакомить с наиболее распространенными методами микроскопического анализа в КДЛ.

ЛИТЕРАТУРА

1. Камышников В.С. Методы клинических лабораторных исследований. – Мн., “Белорусская наука”, 2001 г., с. 423-426.

2. Клинико-лабораторные аналитические технологии и оборудование / Под ред. В.В. Меньшикова В.В. - М., 2007

3. Клиническая лабораторная аналитика / Под ред. В.В. Меньшикова В.В. - М., 2002

МАТЕРИАЛЬНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ

Мультимедийная презентация

РАСЧЕТ УЧЕБНОГО ВРЕМЕНИ

№ п/п	Перечень учебных вопросов	Время в минутах
	Вступление	3 мин
1.	Принцип действия и устройство микроскопа	20 мин
2.	Приборы и оборудование для микроскопии	20 мин
3.	Преаналитический этап при микроскопическом исследовании клеток	15мин
4.	Цитохимические методы при микроскопии	12 мин
5.	Анализаторы изображения	17 мин
6.	Заключение	3 мин
7.	Всего:	90 минут

С О Д Е Р Ж А Н И Е

Вступление – 3 мин

1. Принцип действия и устройство микроскопа – 20 мин

Потребность в визуальных наблюдениях работников лабораторий за клетками, их структурами или другими корпускулярными компонентами биоматериалов пациентов возникает в следующих случаях: при исследовании мочи, спинномозговой и других биологических жидкостей; подсчете клеток крови в счетных камерах; дифференциальном подсчете лейкоцитов в мазках периферической крови; исследовании клеток в мазках, соскобах, срезах тканей; исследовании микроорганизмов, грибов, паразитарных орга­низмов.

Для этого используют оптические приборы — микроскопы. Микроскоп (от греч. mikros — малый, skopeo — смотрю) — это прибор, позволяющий получать увеличенное изображение объектов и структур, недоступных глазу человека. В медицинских и био­логических исследованиях применяют методы световой и электронной микроскопии. Современные микроскопы — это новое поколение приборов со сложной оптико-механической и электронной конструкцией.

Для освещения используют естественный свет или искусственные источники света. Световые микроскопы могут увеличивать объект размером от 0,5 мкм с разрешением элементов объекта до 0,1 мкм более чем в 1 800 раз.

Электронная микроскопия обеспечивает получение электроннооптического изображения с помощью потока электронов. Построение изображения тоже основано на законах геометрической и волновой оптики, а также на законах электромагнитных полей. Электронная микроскопия делает возможным исследование объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа (менее 0,2 мкм) и применяется для изучения вирусов, бактериофагов, тонкого строения микроорганиз­мов и других субмикроскопических объектов и макромолекулярных структур. Она обеспечивает увеличение объекта в 20 000 раз.

Современные микроскопические приборы подразделяют на следующие группы: биологические микроскопы (проходящего света); инвертированные биологические микроскопы (инвертированные микроскопы проходящего света), люминесцентные микроскопы; поляризационные микроскопы проходящего света; стереоскоптические микроскопы; анализаторы изображения. По степени сложности каждую группу микроскопов можно разделить: на учебные; рутинные; рабочие; лабораторные; исследовательские.

Микроскоп состоит из нескольких функциональных частей: механической, оптической и осветительной системы.

Механическая часть микроскопа представлена основным блоком — штативом, в состав которого входят основание и тубусодержатель. Предметный столик микроскопа, на котором располагают, крепят и фиксируют в определенном положении объект наблюдения, является чисто механическим узлом микроскопа. Он закреплен на специальном кронштейне. Предметные столики могут быть подвижными и неподвижными. Неподвижные столики обычно применяют в самых простейших моделях микроскопов, передвижение объекта на них наблюдатель выполняет вручную. В настоящее время такие микроскопы встречаются очень редко. При оснащении микроскопов подвижными столиками возможно механическое перемещение и вращение объекта под объективом микроскопа. Управляемые от электродвигателя предметные столики называют сканирующими. Механические компоненты микроскопа выполняют не только функцию крепления и обеспечения необходимого взаиморасположения оптических и осветительных компонентов, но и их точного перемещения в процессе фокусирования и наводки на рез­кость, создания оптимальных условий освещения, передвижения и ориентации исследуемого объекта.

Оптическая часть микроскопа обеспечивает его основную функцию, создает увеличенное изображение объекта с достаточной степенью достоверности по форме, соотношению размеров и цвету.

Основными оптическими элементами микроскопа являются объектив, окуляр, конденсор; вспомогательными — осветительная система, оптовар, визуальные и фотонасадки с оптическими адаптерами и проективами.

Принципиальная схема оптической части микроскопа состоит из двух систем линз. Одна из них расположена в окуляре, т. е. устройстве для глаз наблюдателя. Окуляр вставлен в тубус — трубку, по которой свет от наблюдаемого объекта проходит к глазу наблюдателя. Вторая система линз находится в непосредственной близости к изучаемому объекту, поэтому называется объективом. Различными конструкциями микроскопов предусмотрено нали­чие одного, двух или трех окуляров (монокулярные, бинокулярные, тринокулярные микроскопы), нескольких сменных объективов, позволяющих подбирать желательные степени увеличения объекта. Бинокулярные микроскопы удобнее для наблюдателя, поскольку в этом случае есть возможность наблюдать объект двумя глазами одновременно.

Объектив микроскопа выполняет функцию воспроизведения изображения наблюдаемого объекта с требуемым увеличением при разрешении элементов изображения, необходимом для их детального изучения, и при точном воспроизведении их по форме и цвету. Объективы имеют сложную конструкцию, которая включает несколько одиночных и склеенных компонентов из двух, трех, а иногда до 13—14 линз.

Маркировка объективов осуществляется в соответствии с системой надписей на их корпусе, принятой Международной организацией по стандартизации (ISO). Большое значение имеет наличие иммерсионной среды между объектом и объективом, толщина покровного стекла. В некоторых технологиях микроскопирования существует также необходимость выполнения работ непосредственно под микроскопом. В них очень важна такая характеристика, как рабочее (свободное) расстояние между объективом и объектом. Такие объективы называют объективами с большим рабочим расстоянием.

При работе с иммерсией применяют три типа иммерсионных жидкостей: масляную (МИ/Oil), водную (ВИ/W) и глицериновую (ГИ/Glyc). Последнюю в основном применяют в ультрафиолетовой микроскопии. Иммерсионная жидкость необходима для повышения разрешающей способности микроскопа; в соответствии с технологией микроскопирования; повышения видимости за счет увеличения разности показателя преломления среды и объекта; увеличения глубины просматриваемого слоя, который зависит от показателя преломления среды. Иммерсионная жидкость может уменьшать количество рассеянного света за счет устранения бликов от объекта. При этом исключаются неизбежные потери света при попадании его в объектив.

Осветительная система — это система линз, диафрагм и зеркал (при необходимости), обеспечивающая равномерное освещение объекта и полное заполнение апертуры объектива. В нее входят: источник света (естественный или искусственный); коллектор — оптическая система, проецирующая нить лампы в плоскость апертурной диафрагмы конденсора, при этом нить лампы увеличивается до размера диафрагмы. При встроенной осветительной системе проходящего света коллекторная часть расположена вблизи источника света в основании микроскопа и предназначена для увеличения размера светящегося тела. Для обеспечения настройки коллектор может быть выполнен подвижным и перемещаться вдоль оптической оси. Вблизи коллектора расположена полевая диафрагма микроскопа.

Конденсор — оптическая система, которая проецирует полевую диафрагму коллектора в плоскость предмета, обеспечивая требуемую числовую апертуру осветительного пучка, она предназначе­на для увеличения количества света, поступающего в микроскоп. В микроскопах проходящего света конденсор расположен между объектом (предметным столиком) и источником света (коллек­тор, зеркало). В микроскопах отраженного света роль конденсора выполняет объектив.

В качестве источника света в осветительной системе используется естественный свет, а также искусственное освещение, создаваемое лампами накаливания, галогенной, ртутной лампами. С формой и размером нити лампы связаны габаритные размеры и увеличение осветительной системы. Мощность, габаритные размеры источника света влияют на параметры и габаритные размеры блока питания лампы, и все это влияет на размеры и дизайн самого микроскопа.

В отечественных световых микроскопах использовали лампу накаливания РН8-20-1, а в современных микроскопах отечественного и зарубежного производства применяют в основном галогеновые лампы, чаще всего фирмы «OSRAM» (Германия), с напряжением 6 В, мощностью 20 или 30 Вт. В ис­следовательских микроскопах применяют более мощные лампы — напряжением 12 В и мощностью 50 или 100 Вт.