Лекции / Молекулярно

Слайд Оборудование ПЦР-лаборатории

Организация лаборатории для ПЦР и правила работы регламентируются нормативными документами.

Требования к площади: 2 — 3 комнаты общей площадью не менее 60 м², оснащенных водопроводом и приточно-вытяжной вентиляцией. В случае использования электрофореза для разделения ампликонов три процедуры (подготовка анализируемых проб, амплификация и детекция результатов) должны быть физически изолированы друг от друга для предотвращения контаминации, и проводиться в разных помещениях, оснащенных предбоксами.

Минимальный комплект оборудования (при электрофоретической детекции результатов): амплификатор термоциклер); термостат для термоподготовки проб; настольная центрифуга; центрифуга-вортекс; камера для электрофореза 9^х 13 см; источник питания для электрофореза; трансиллюминатор («столик с подсветкой») для просмотра гелей, охладитель для пробирок; ламинарный бокс.

Слайд Подготовка образца для тестирования НК

• Правильный выбор биологического материала, с наибольшей вероятностью позволяющий обнаружить предполагаемый генетический дефект. Наиболее частый материал - клетки крови. Плазма крови - при пренатальной диагностике, обнаружении ряда онкомаркеров.

• Соблюдать требования к взятию материала

• Правильно избрать участок ДНК для каждого аналита или возбудителя, используя высококонсервативные области генома, специфичные для данного организма (опасность ложноположительных результатов)

• Соблюдать условия приготовления основных растворов и обработки проб: отдельная чистая комната или зона (оптимально – ламинарный шкаф).

Слайд Полимеразная цепная реакция

Разработана К. Мюллисом в 1983 г. (Нобелевская премия 1993 г.)

Принцип метода. комплементарное достраивание ДНК-матрицы, осуществляемое in vitro с помощью фермента ДНК-полимеразы. При многократном повторении циклов синтеза происходит экспоненциальное (в геометрической прогрессии) увеличение количества копий специфического фрагмента ДНК. Многократно копируемый участок ДНК заведомо выбран исследователем и является специфическим, уникальным (например для данного вида возбудителя).

Слайд ПЦР с использованием обратной транскриптазы.

Применяется для идентификации РНК вирусов.

Используемые приемы:

1) использование дополнительного фермента — РНК-зависимая ДНК-полимераза — обратная транскриптаза. Обеспечивает образование однонитевых фрагментов ДНК (по РНК), дальнейшая амплификация с помощью Taq-полимеразы;

2) использование специального фермента ДНК-зависимой ДНК-полимеразы, (выделена из другого термофильного микроба - Thermus thermophilus) - Tth-полимераза. Катализирует в присутствии ионов марганца синтез на РНК однонитевой комплементарной ДНК , а затем при добавлении в среду ионов магния и хелаторов ионов марганца этот же фермент катализирует обычную ДНК-зависимую ДНК-полимеразную реакцию.

Слайд ПЦР in situ

Позволяет специфически амплифицировать и локализовать какую-либо последовательность ДНК внутри клетки. Внутриклеточное обнаружение продуктов ПЦР можно выполнять через непрямую гибридизацию in situ или без этого этапа, с прямой детекцией меченых нуклеотидов. При непрямой ПЦР in situ после проведения амплификации и гибридизации ПЦР-продукт взаимодействует с пробой, меченной флюо-рохромом. При прямой детекции меченые нуклеотиды включаются непосредственно в состав амплифицируемого продукта.

Метод неоценим в исследовании вирусных инфекций и экспрессии генов в клетке, в оценке эффекта действия новых лекарственных средств на клеточном и молекулярном уровнях.

Слайд ПЦР в реальном времени

Особенность: детекция продуктов ПЦР происходит непосредственно во время амплификации.

Преимущества:

• возможность размещения в одной комнате,

• исключение контаминации продуктами реакции,

• снижение трудозатрат

• параллельная детекция до 4-х возбудителей в одном образце

Необходимое оборудование: специальный прибор, состоящий из 3-х блоков - амплификатор, флуоресцентный детектор, компьютер.

Слайд Выявление продуктов амплификации в ПЦР real time

Используют 2 основных подхода:

• Интеркалирующие красители. Принцип – флуоресценция метки (бромистого этидия) значительно возрастает при внедрении в двойную цепь молекулы ДНК, а, следовательно, дает возможность наблюдать накопление продуктов амплификации.

• ДНК-зонды. Состав ДНК-зонда: флуоресцентная метка+гаситель флуоресценции. При нахождении в растворе свечении отсутствует, при присоединении зонда к комплементарной цепи ДНК – свечение, прямо пропорциональное количеству ампликонов.

Слайд Лигазная цепная реакция

ЛЦР основана на способности фермента ДНК-зависимой ДНК-лигазы сшивать (лигировать) цепь ДНК в присутствии АТФ и ионов магния. Лигазная цепная реакция использует две пары праймеров комплементарных друг другу и исходно выбранному фрагменту матрицы (например, ДНК какого-либо инфекционного агента). В ходе ЛЦР накапливается двунитевый фрагмент ДНК — продукт, 'полностью идентичный по структуре четырем используемым праймерам.

Использование: для выявления различных инфекционных агентов, содержащих ДНК (например, возбудителей хламидиоза — Chlamydia trachomatis и туберкулеза — Mycobacterium tuberculosis) с помощью готовых наборов реактивов заводского производства. Удобен для автоматизации, может быть объединен с ПЦР или другими методами.

Слайд Реакции транскрипционно-опосредованной амплификации.

Используется преимущественно для выявления РНК.

Основные этапы:

1. Подготовка пробы:

Выделение РНК из вируса с помощью детергента

Извлечение из пробы при помощи магнитного поля выделенной РНК и РНК внутреннего контроля.

2. Амплификация РНК

Амплификации подвергается связавшаяся с магнитными частицами мишеневая РНК, которая служит матрицей в процессе синтеза РНК-транскриптов.

3. Детекция РНК-ампликонов

Добавление специфических зондов, гибридизация их с РНК-ампликонами, детекция флуоресцентного продукта.

Слайд ДНК/РНК-гибридный захват.

Относится к технологиям амплификации сигнала.

Основан на иммунохимической детекции продуктов гибридизации нуклеиновых кислот РНК/ДНК или ДНК/РНК с помощью моноклональных антител, распознающих образующиеся дуплексы (двойные цепи) нуклеиновых кислот. Для обнаружения бактерий или ДНК-содержащих вирусов применяют РНК-зонд. В случае выявления РНК-содержащих инфекционных агентов (вирус гепатита С) используют ДНК-зонд.

Используется для скрининга, так как здесь сведены к минимуму процессы подготовки биожидкости для исследования и очистки нуклеиновых кислот.

Слайд

Слайд Метод гибридизации с использованием разветвленных зондов

Метод амплификации сигнала в ходе определения, независимый от праймеров.

Основан на связывании синтетических, разветвленных молекул ДНК с искомой нуклеиновой кислотой. В результате многоступенчатого процесса гибридизации происходит присоединение многочисленных зондов, конъюгированных с молекулами фермента, окисляющего люминогенный субстрат и запускающего таким образом хемилюминесценцию.

Используется для количественной оценки содержания нуклеиновых кислот в биожидкостях. Используются специальные коммерческие тест-системы.

Слайд Сфера применения молекулярно-биологических методов:

• Акушерство: предимплантационная и пренатальная диагностика, скрининг новорожденных.

• Терапия - генетическая предрасположенность к различным заболеваниям

• Онкология:

• диагностика наследственных моногенных форм рака путем выявления мутаций в определенных генах-супрессорах опухолевого роста, специфичных для каждой формы рака;

• диагностика молекулярных маркеров неблагоприятного прогноза, создания своеобразного молекулярного портрета опухоли, полученного при сочетании методов классической и молекулярной цитогенетики и ДНК-диагностики;

• поиск маркеров и диагностики микрометастазов;

• диагностика маркеров начальных стадий опухолевого процесса, в частности, аномального метилирования генов до появления признаков наличия опухоли (прогностическая диагностика при диспансеризации групп риска);

• диагностика полиморфных ДНК-маркеров риска развития определенного типа опухолей.

Слайд Применение молекулярно-биологических методов (продолжение)

Клиническая микробиология:

• Установление этиологического диагноза (поиск и идентификации генов микроорганизмов)

• генов резистентности к определенным лекарственным препаратам,

• оценка генов, контролирующих иммунный ответ организма человека (рецепторов связывания бактерий и вирусов; генов, регулирующих синтез цитокинов и хемокинов)

• "фармакогенов" (генов, регулирующих фармакокинетику и модифицирующих эффект действия противомикробных лекарственных средств).

Клиническая фармакология - генотипирование ферментов метаболизма лекарственных средств и выявление степени чувствительности или резистентности к определенным препаратам.