Иммуноанализ с использованием меченых
антигенов или антител (immunoassay)
Принцип: образовавшиеся в ходе иммунохимической реакции или изолированные комплексы «антиген— антитело» соединяются с другими партнерами по реакции (т.н. «маркеры», «метки»), способствующими обнаружению или количественному определению исследуемого вещества. Метка может быть соединена с антителом или антигеном. Этот комплекс называется конъюгатом.
Метки:
радиоактивные изотопы - радиоиммунные методы (РИА);
ферменты - иммуноферментные методы (ИФА);
люминесцирующие вещества - –иммунолюмисцентные методы;
флюоресцирующие вещества - иммунофлюоресцентные методы
Гомогенный и гетерогенный иммуноанализ
Гомогенный иммуноанализ - об образовании комплекса АГ-АТ судят по появлению новых свойств метки (потеря активности). Нет необходимости в этапе их физического разделения.
Гетерогенный иммуноанализ - одна из фракций прикрепляется к твердой фазе, покрытой антигеном или антителом, поэтому другие фракции должны быть удалены (отмыты, отцентрифугированы). Используются 2 основных подхода – конкурентный и неконкурентный иммуноанализ.
Схема гомогенного ИФА
|
|
|
Антитело |
|
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Антитело |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Детек- |
|
Аналит |
|
|
|
|||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Аналит |
|
|
|
ция |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Отсутствуют процедуры разделения между несколькими реакционными стадиями
Конкурентный иммуноанализ
Конкурентный иммуноанализ (конкурентное связывание, сатурационный анализ)
1.Реактивы смешивают одновременно: исследуемое вещество (антиген) + известное количество аналогичного меченого антигена + АТ к антигену → конкуренция меченого и немеченого антигенов за АТ. Несвязанную фракцию удаляют отмыванием. Учет: чем ниже концентрация антигена, тем больше меченого аналога свяжется с антителами.
2.Последовательная постановка реакции: исследуемый материал (антиген) + АТ в избытке, затем + меченый антиген. Несвязанную фракцию удалить отмыванием. Учет аналогично 1.
Конкурентный метод
Неконкурентный иммуноанализ
Метод «сэндвича»
Принцип: каждый белок имеет много детерминант — участков, к которым могут подсоединяться антитела, причем антитела также являются белками, которые могут связываться с соответствующими антителами.
Постановка: на твердой фазе (например, полистирольной ячейке) адсорбированы специфичные антитела + биоматериал (АГ) → отмывание + избыток меченых АТ → отмывание → ферментативная реакция → учет.
Обязательное условие – в качестве аналита использовать вещества с достаточно большой молекулярной массой.
Гетерогенный иммуноферментный анализ
сэндвич метод
Иммуноблоттинг
Блоттинг —перенос электрофоретически разделенных белков на иммобилизованные матрицы.
Иммуноблоттинг - + иммунохимический анализ разделенных фракций.
Преимущества -
получение на матрице идеальной копии электрофоретического разделения белков, присутствующих в геле;
возможность проведения с образцом на матрице различных аналитических процедур, что в гелях невозможно);
возможность элюировать лиганды с иммобилизованного антигена
Высокая чувствительность и специфичность метода Используется для анализа белков, ДНК, РНК.
Разновидности блоттинга
Саузерн блоттинг—метод переноса фрагментов ДНК (с агарозы на нитроцеллюлозу под действием капиллярных сил). Далее они гибридизируются с радиоактивной РНК для проверки комплементарных последовательностей.
Норзерн блоттинг - перенос и анализ фрагментов РНК.
Вестерн блоттинг - метод переноса фрагментов белка (с додецилсульфатполиакриламидных
гелей на полосу чистой немодифицированной нитроцеллюлозы).
