Лекции / ПЦР

Реакция гибридизации мишеневой ДНК или РНК.

Слайд Основные этапы проведения ПЦР

Разработана Кэрри Мюллисом в 1983 г. (Нобелевская премия 1993 г. в области химии). Практическое применение с 1985 г.

1. подготовка пробы (2 часа)

   1. Выделение ДНК из клетки -обработка пробы детергентом (солюбилизация оболочки, денатурация белков)

   2. Внесение выделенной ДНК в амплификационную пробирку (master mix), содержащую компоненты, необходимые для амплификации: Tag-полимераза, 2 вида праймеров (один комплементарен последовательности нуклеотидов одной из цепей ДНК в начале гена, другой комплементарен второй цепи в конце гена), нуклеотиды, солевой буфер (оптимальный для работы фермента состав).

Tag-полимераза – термостабильная ДНК-зависимая ДНК-полимераза из термофильных бактерий Thermus aquaticus, оптимум работы 70-72⁰С.

Слайд Амплификация

В ПЦР это серийные 3-х стадийные температурозависимые циклы (продолжительность 3-5 мин каждый).

Один цикл реакции состоит:

1. Денатурация ДНК (1 мин): плавление ДНК (при 95⁰С) и разъединение цепей ДНК, в результате чего цепочки ДНК становятся доступными для праймеров.

2. Отжиг праймеров с мДНК (1-2 мин). Это присоединение праймеров к мДНК. Происходит при t 60⁰С от 3' конца мДНК по одному праймеру на каждую цепь. Присоединенные праймеры ориентированы в направлении 5' -3', при этом 3' концы обращены друг к другу.

3. Элонгация - синтез двойной спирали ДНК от праймеров в сторону 5' конца на матрице мишеневой ДНК при оптимуме температуры, используя нуклеотидов из master mix под действием фермента Tag-полимераза.

Цель цикла – получить 2 копии заданного гена. Прибор – термоциклер.

Слайд Амплификация (продолжение)

После первого цикла амплификации синтез первых двух копий мДНК заканчивается произвольно (праймерами не ограничен), поэтому на обоих их 3' концах образуются «лохмотья», то есть участки нити ДНК различной длины. Со второго цикла амплификации начинают синтезироваться ампликоны.

Ампликоны – короткие, ограниченные по длине с 3' и 5' концов праймерами, продукты амплификации мДНК.

Циклы амплификации повторяются многократно (30-50 раз), в результате каждого последующего цикла количество ампликонов удваивается и становится достаточным для детекции.

Слайд Детекция ампликона

1. Электрофорез в агарозном геле

2. ИФА специальные наборы

3. Использование специальных ДНК-зондов

Слайд Применение ПЦР в КЛД

1. Диагностика и мониторинг инфекционных заболеваний

Диагностика хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, вирусных инфекций, микоплазм, гарднерелл, микобактерий, кампилобактерий и др.

2. Анализ антибиотикорезистентности у медленно растущих и труднокультивируемых бактерий

3. Диагностика наследственных заболеваний – муковисцидоз, гемофилия, талассемия, серповидно-клеточная анемия и др.

4. HLA-типирование – анализ на гистосовместимость (трансплатнация), идентификация личности (криминалистика).

Слайд Аналитические преимущества и недостатки метода ТНК

Преимущества:

• Высокая аналитическая и диагностическая чувствительность и специфичность

• Быстрота выполнения

• Идентификация и определение свойств микроорганизмов, не размножающихся в лабораторных условиях, сапронозов (находятся во внешней среде в «некультивируемом» состоянии)

Недостатки:

• Перекрестная контаминация проб, контаминация реакционной смеси и лабораторного оборудования ранее амплифицированным материалом. Возможности устранения – применение системы защиты от контаминации

• Возможности метода ограничены наличием высокоспецифичных праймеров

Слайд Клинические проблемы, связанные с применение технологий ТНК;

1. Высокая чувствительность – детекция чрезвычайно низких количеств патогенна не имеющих клиническое значение.

2. Сложно использовать для мониторирования эффективности терапии, в связи с тем, что метод детектирует как живые, так и погибшие микроорганизмы.

Слайд ПЦР в реальном времени