3. Лигазная цепная реакция – 10 мин

Лигазная цепная реакция (ЛЦР) основана на способности фер­мента ДНК-зависимой ДНК-лигазы сшивать (лигировать) цепь ДНК в присутствии АТФ и ионов магния при наличии разорванной фосфодиэфирной связи. Фермент высокоспецифичен при лигировании одноцепочечных разрывов на матрице, которая представляет собой вторую комплементарную цепь. Лигазная цепная реакция использует две пары праймеров комплементарных друг другу и исходно выбранному фрагменту матрицы (например, ДНК какого-либо инфекционного агента) по принципу «голова к хвосту» в направлении 5'—3'. Таким образом, в ходе ЛЦР начинает накапливаться дотированный двунитевый фрагмент ДНК — продукт, 'полностью идентичный по структуре четырем используемым праймерам. Эту реакцию широко испольиспользуют для выявления различных инфекционных агентов, содержа­щих ДНК (например, возбудителей хламидиоза — Chlamydia trachomatis и туберкулеза — Mycobacterium tuberculosis) с помощьюготовых наборов реактивов заводского производства. Метод удобен для автоматизации, может быть объединен с ПЦР или другими методами.

4. Другие молекулярно-биологические технологии – 12 мин

Реакции транскршщионно опосредованной амплификации. Наиболее распространенная технология — амплификация, основанная на чередовании последовательности нуклеиновых кислот (Метод используют в основном для репликации РНК. При реверсивной транскрипции сДНК образуется из искомой РНК.

ДНК/РНК-гибридный захват. Данная методика относится к тех­нологиям амплификации сигнала. Принцип основан на иммунохимической детекции продуктов гибридизации нуклеиновых кислот РНК/ДНК или ДНК/РНК с помощью моноклональных антител, распознающих образующиеся дуплексы (двойные цепи) нуклеиновых кислот. Для обнаружения бактерий или ДНК-содержащих вирусов применяют РНК-зонд. В случае выявле­ния РНК-содержащих инфекционных агентов (вирус гепатита С) используют ДНК-зонд. Здесь сведены к минимуму процессы подготовки биожидкости для исследования и очистки нуклеиновых кислот, что позволяет использовать иммунохимическую детекцию РНК/ДНК-гибрида для скрининга.

Метод гибридизации с использованием разветвленных зондов (ЬДНК, branched DNA-test). Это — метод амплификации сигнала в ходе определения, независимый от праймеров, основан на связывании синтетических, разветвленных молекул ДНК с искомой нуклеиновой кислотой. В результате многоступенчатого процесса гибриди­зации происходит присоединение многочисленных зондов, конъюгированных с молекулами фермента, окисляющего люминогенный субстрат и запускающего таким образом хемилюминесценцию.

5. Технологии биочипов – 12 мин

Биочипы, микрочипы лабораторные аналитические (микрочипные анализаторы, геносенсоры, микрототальные аналитические системы) — это миниатюрные аналитические устройства, изготовленные из силикона, кварца, стекла, пластмасс с применением фотолитографии. Необходимые для проведения аналитических процедур компоненты — каналы, камеры — формируют способом фотолитографии или реактивной ионной гравировки, используют сверление лучом лазера, а особенно малые компоненты (размером 0,1 мкм) получают методом гравировки рентгеновскими, электронными лучами или другими способами, заимствованными из технологий производства компонентов микроэлектроники.

Создание лабораторного микрочипа, являющегося средством миниатюризации лабораторных технологий и лабораторного оборудования, вызвало, в сущности, революционный переворот в лабораторных и научных исследованиях. Микрочипные анализаторы позволяют существенно сократить расход биоматериалов, калибраторов, реактивов, времени анализа, максимально стандартизовать аналитический процесс, упростить работу, повысить производи­тельность, снизить стоимость анализа. Устройства этого типа были созданы впервые при проведении работ по расшифровке генома человека и поиска эффективных лекарственных средств среди сотен вариантов химических соединений близкой структуры.

Типовые размеры микрочипа — 1,5x1,5 см при толщине в несколько миллиметров. Технология ДНК-чипов основана на гибридизации неизвестной нуклеотидной последовательности с расположенными в определенном порядке известными ДНК-последовательностями, иммобилизованными на поверхности стекла или кремния. Результат определяют по флюоресценции зонда, предварительно меченного флюорофором и гибридизованного с одной из иммобилизованных проб. Детекцию гибридизационного сигнала на ДНК-чи­пах проводят специально разработанными сканерами флюорес­ценции. В последние годы предприняты попытки внедрить новые высокочувствительные методы детекции, такие как массспектрометрия, хемилюминесценция, оптоволоконная техника.

ДНК-чипы имеют несколько преимуществ перед другими традиционными молекулярно-биологическими технологиями. В них осуществлен принцип миниатюризациии дифференциальной последовательности анализируемой пробы, а также полная автоматизация рабочего места. Они могут быть использованы неоднократно (за исключением ДНК-чипов на гелевых подложках).