2. Полимеразная цепная реакция – 20 мин

Принцип метода. В основе метода ПЦР лежит комплементарное достраивание ДНК-матрицы, осуществляемое in vitro с помощью фермента ДНК-полимеразы. Эта реакция носит название репликации ДНК. Естественная репликация протекает в несколько стадий: 1) денатурация ДНК (расплетение двойной спирали, расхождение нитей ДНК); 2) образование коротких двунитевых участков ДНК («затравок», необходимых для начала синтеза ДНК); 3) синтез новой цепи ДНК (комплементарно, для получения копий ко­ротких участков ДНК, специфичных, например, для конкрет­ных микроорганизмов, т. е. происходит целенаправленный поиск таких специфических участков, что и служит целью генетиче­ской диагностики для выявления возбудителей инфекционных заболеваний).

Открытие термостабильной ДНК-зависимой ДНК-полимера­зы (Taq-полимеразы) из термофильных бактерий Thermus aquaticus с оптимумом реакции при температуре 70 —72 "С позволило сделать процесс репликации ДНК циклическим.

По своему принципу, ПЦР — метод многократно повторяющихся циклов ферментативного синтеза in vitro специфических нуклеотидных последовательностей ДНК-матри­цы, катализируемого ферментом ДНК-зависимой ДНК-полимеразой (амплификация).

Многократно копируемый участок ДНК заведомо выбран исследователем из известной нуклеотидной последовательности определенного фрагмента ДНК-матрицы, который является маркер­ным, т.е. специфическим, уникальным, например для данного вида возбудителя. С внедрением этого метода отпала необходи­мость выделять и очищать ДНК-мишень. Очень небольшой по объему и необработанный материал может быть исследован и подвергнут детекции. Комплементарное достраивание цепи ДНК начина­ется не в любой точке последовательности ДНК, а только в опре­деленных стартовых блоках — коротких двунитевых участках. В случае присоединения таких блоков к специфическим участкам ДНК можно направить процесс синтеза новой цепи только в этом уча­стке, а не по всей длине цепи ДНК.

Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют две олигонуклеотидные «затравки», содержащие 18 — 35 нуклеотидов, которые комплементарны последовательностям ДНК на правой и левой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК происходит только между ними.

Каждый цикл амплификации при полимеразной цепной реакции протекает в присутствии следующих основных компонентов:

ДНК-матрица (ДНК или ее часть, содержащая искомый спе­цифический фрагмент ДНК в образце любого происхождения, в частности в любой биожидкости);

два синтетических олигонуклеотидных праймера, комплемен­тарные участкам ДНК, находящимся на противоположных нитях на границах определяемого специфического фрагмента и фланки­рующим искомую мишенную последовательность ДНК;

четыре дезоксирибонуклеотида (дНТФ) — смесь дезоксирибо-аденозинтрифосфата, дезоксирибоцитидинтрифосфата, дезоксири-богуанозинтрифосфата, дезоксириботимидинтрифосфата, явля­ющихся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК;

термостабильная ДНК-зависимая ДНК-полимераза, выдержи­вающая нагревание до 95 °С, катализирующая удлинение цепей праймеров путем последовательного присоединения нуклеотид­ных оснований из смеси дезоксирибонуклеотидов к растущей цепи синтезируемой ДНК;

соответствующий солевой буфер, реакционная среда с обяза­тельным присутствием ионов магния, необходимых для поддер­жания активности ДНК-зависимой ДНК-полимеразы.

Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играют важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа.

Для получения достаточного количества копий искомого специфического фрагмента амплификация ДНК должна включать несколько (20—40) циклов. Каждый цикл этапов (фаз), протекающих при различных температурных мах. Продолжительность каждого этапа зависит от конкретного определяемого аналита, используемого набора реактива и типа амплификатора.

1-й этап — денатурация ДНК (расплетение двойной i протекает при температуре 93 — 95 °С в течение 30 — 40 с.

2-й этап — присоединение праймеров (отжиг), проис комплементарно к соответствующим последовательное^ противоположных однонитевых цепях ДНК на границах cnei ческого участка. Для каждой пары праймеров существует своя ^ ратура отжига в интервале 50—65 "С. Продолжительность отж 20-60 с.

3-й этап — элонгация — комплементарное достраивание ДНК, происходит от 5'-конца к 3'-концу цепи в проти ложных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат, как указано ранее, дНТФ. Процесс синтеза происходит при температуре 70-72С. продолжительность этапа –20-40 с.

Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента «ДНК-ампликона». В течение следующих циклов копии праймеров специфически гибридизуются с новыми участками. В результате образуются фрагменты одинаковой длины — ампликоны, концы которых завершаются праймерами. Во время каждого цикла количество вновь синтезированных цепей ДНК удваивается. Итак, ампликоны - специфические продукты амплификации, ограниченные двумя праймерами, образуются, начиная со второго цикла.

Образованные во втором цикле ПЦР из одной материнской ДНК два синтезированных участка также служат матрицами для последующих циклов ПЦР. Начиная с третьего цикла, образуются ампликоны со строго определенным количеством нуклеотидов, и, следовательно, с определенной молекулярной массой, что по­зволяет в классическом методе детекции — гель-электрофорезе выявить эти ампликоны. Так, специфический фрагмент ДНК мо­жет быть копирован миллиард раз за короткое время.

Если для выявления нуклеиновой кислоты-мишени методом гиб­ридизации in situ с применением радиоактивного меченого зонда необходимо, чтобы мишень присутствовала в препарате в нескольких тысячах копий, то при ПЦР интересующая последовательность может быть первоначально представлена лишь одной молекулой. По окончании первого цикла ПЦР из одной молекулы ДНК образуются две новые, идентичные оригинальной. Поскольку праймеры

гибридизуются с обеими цепями ДНК, то и нативная последователь­ность, и синтезируемые ПЦР-продукты могут служить матрицами в последующих циклах репликации. В результате число копий уни­кальной последовательности увеличивается экспоненциально. Благодаря этому последовательности, присутствующие в изучаемом материале в минимальном количестве (одна или несколько копий) и не поддающиеся обнаружению никакими другими методами, легко выявляются с помощью ПЦР.

Увеличение числа копий ДНК носит экспоненциальный ха­рактер только в первых 20 — 25 циклах, в дальнейшем в результате истощения дНТФ, снижения активности Taq-ДНК-полимеразы увеличение количества образующихся копий прекращается.

Итак, схема ПЦР-диагностики выглядит следующим образом:

1)взятие биоматериала для исследования;

2)пробоподготовка (выделение нуклеиновых кислот);

3)постановка и проведение собственно ПЦР;

4)детекция ампликонов (электрофорез в геле, планшетная гибридизация);

5)интерпретация результатов.

Модификации методов с использованием ПЦР. Полимеразная цепная реакция с использованием обратной транскриптазы. Технология применяется для идентификации РНК вирусов. Особенности: 1)применяют дополнительный фермент — РНК-зависимую ДНК-полимеразу — обратную транскриптазу. В результате реакции, катализируемой этим ферментом, образуются однонитевые фрагменты ДНК, которые в дальнейшем используются в ампли­фикации с помощью Taq-полимеразы;

2)применяют ДНК-зависимую ДНК-полимеразу, с помощью которой в присутствии ионов марганца можно катализировать синтез на РНК однонитевой комплементарной ДНК.

Мулыпипраймерная ПЦР. В ходе мультипраймерной ПЦР процесс коамплификации нескольких матриц ДНК происходит в одной реакционной среде с несколькими парами праймеров. Это дозволяет одновременно провести, например, скрининг по нескольким возбудителям инфекционных болезней, исследовать состояние нескольких аллельных генов у эукариотических организмов, в том числе и у человека.

Гнездовая ПЦР. Это модификация ПЦР, при которой используют две пары праймеров, одна из которых участвует в амплификации внутреннего участка ампликона, полученного после предварительного цикла амплификации с внешней парой праймеров. Этот вариант ПЦР характеризуется высокой чувствительностью.

ПЦР в реальном времени. Наиболее технологичным подходом в создании количественного метода является ПЦР в реальном времени. Характерной чертой этого метода является возможность прямого определения продуктов реакции непосредственно в процессе амплификации без последующего электрофореза. Для постановки ПЦР в реальном времени необходим специальный амплификатор, с помощью которого можно детектировать и регистри­ровать флюоресценцию, отражающую накопление ампликонов, на каждом цикле амплификации.

Регистрация накопления продуктов реакции и построение калибровочных кривых происходит по реальным процессам в каждой конкретной пробирке.

Методы детекции продуктов амплификации. Для детекции и регистрации продуктов амплификации можно использовать различные методы: электрофоретическое разделение ампликонов с последующей их визуализацией окрашиванием. К другим методам анализа ампликонов относят высокоэффек­тивную жидкостную хроматографию, капиллярный электрофорез, масс-спектрометрию. Аналогичные методы используют в биологических устройствах — микросистемах-биочипах. Большинство биочипов является устройствами для детекции продуктов аплификациии технические принципы их работы будут описаны далее

Особенности и преимущества ПЦР.

Высокая специфичность и чувствительность метода, что и позволяет использовать малое количество (0,01 — 0,1 мл) любого исследуе­мого материала, в том числе и гистологические препараты. Ни один из существующих в настоящее время методов не обладает большей чувствительностью, чем методы с ПЦР.

Приборы, оборудование и другие средства для ПЦР.

Для ПЦР-лаборатории необходимо иметь 2 — 3 комнаты общей площадью не менее 60 м², оснащенных водопроводом и приточно-вытяжной вентиляцией. В случае использования электрофореза для разделения ампликонов три процедуры (подготовка анализируе­мых проб, амплификация и детекция результатов) должны быть физически изолированы друг от друга для предотвращения контаминации, и проводиться в разных помещениях, оснащенных предбоксами. Каждая рабочая комната должна иметь источник УФ-излучения с дли­ной волны около 260 нм.

При работе с потенциально инфицированным материалом необходим автоклав. Все лабораторное оборудование, пипетки, штативы, посуда, рабочие растворы должны быть строго стационарными.

Основным прибором для постановки ПЦР является амплификатор, или термоциклер, в гнезда которого устанавливают специальные амплификационные пробирки, изготовленные из теплопроводного пластика, или предметные стекла. В эти пробирки с ПЦР-смесью вносят необходимое количество образца с выделенной ДНК. После этого пробирки, закрытые крышками, помещают в амплификатор. Он представляет собой программируемый тер­мостат.

Для выявления продуктов амплификации методом электрофореза в агарозном геле используют электрофоретические камеры, представляющие собой готовые к работе системы. Формат геля определяет пропускную способность камеры, т.е. количество об­разцов для разделения.

Трансиллюминаторы («столики с подсветкой») представляют собой несложные приспособления, предназначенные для просмот­ра гелей, а также для документации результатов, если составляют часть документирующей системы. Их главной особенностью явля- ются специальные лампы (4—6 шт.), излучающие ультрафиолет товый свет различной интенсивности.

Гибридизационные методы регистрации результатов позволяют существенно повысить специфичность определения, а выполнение в планшетах делает возможными стандартизацию и автома­тизацию процесса. В зависимости от метки, входящей в олигонуклеотидный зонд, используют различные способы детекции гибридизационного комплекса (прямое измерение флюоресценции, иммуноферментный анализ). Гибридизационные системы детекции на планшетах явились прообразом при создании современных ДНК-биочипов.