Министерство здравоохранения Республики Беларусь

Учреждение образования

«Гомельский государственный медицинский университет»

Кафедра клинической лабораторной диагностики

Обсуждено на заседании кафедры

протокол № _________

«___» ______________200_ г.

Лекция

по клинической лабораторной диагностике

для студентов __3_ курса ____медико-диагностического ____ факультета

Тема: Молекулярно-биологические технологии

Время ___ 2 часа____

Учебные и воспитательные цели:

1. Сформировать представление об современных методах молекулярно-биологического анализа в клинико-диагностической лаборатории.

2. Рассмотреть принципы, методические и аналитические особенности методов молекулярно-биологического анализа.

3. Ознакомить с наиболее распространенными методами молекулярно-биологического анализа в КДЛ.

ЛИТЕРАТУРА

1. Камышников В.С. Методы клинических лабораторных исследований. – Мн., “Белорусская наука”, 2001 г., с. 423-426.

2. Клинико-лабораторные аналитические технологии и оборудование / Под ред. В.В. Меньшикова В.В. - М., 2007

3. Клиническая лабораторная аналитика / Под ред. В.В. Меньшикова В.В. - М., 2002

МАТЕРИАЛЬНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ

Мультимедийная презентация

РАСЧЕТ УЧЕБНОГО ВРЕМЕНИ

№ п/п	Перечень учебных вопросов	Время в минутах
	Вступление	3 мин
1.	Основные положения и принципы методов	15 мин
2.	Полимеразная цепная реакция	20 мин
3.	Лигазная цепная реакция	10 мин
4.	Другие молекулярно-биологические технологии: реакции транскрипционно опосредованной амплификацц, ДНК/РНК гибридный захват, метод гибридизации с использованием разветвленных зондов.	12 мин
5.	Технологии биочипов	12 мин
6.	Области применения молекулярно-биологических технологий	15 мин
7.	Заключение	3 мин
8.	Всего:	90 минут

С О Д Е Р Ж А Н И Е

Вступление – 3 мин

1. Основные положения и принципы методов – 15 мин

,

Молекулярно-биологические диагностические технологии заключаются в гибридизации и амплификации нуклеиновых кислот. Общим для этих процессов является воспроизведение механизма дублирования наследственной информации в геноме. Последовательность нуклеотидов в одиночной цепи ДНК или РНК закономерно воспроизводится в последовательности нуклеотидов комплементарной цепи благодаря способности гуанина соединяться по принципу «ключ — замок» только с цитозином, тогда как аденин соединяется только с тимином. Считывание информации и воспроизведение цепи ДНК, РНК или определенных их фрагментов происходит с помощью специфических ферментных систем.

При нагревании ДНК и ее быстром охлаждении, обработке щелочью и другими денатурирующими агентами сначала происходит разрыв наиболее слабых водородных связей, в результате из двунитевых образуются однонитевые последовательности нуклеиновой кислоты. Образовавшиеся комплементарные одиночные цепи можно использовать в качестве матрицы для синтеза новых цепей ДНК.

Гибридизация нуклеиновых кислот представляет собой процесс образования стабильных двунитевых молекул нуклеиновых кис­лот из комплементарных однонитевых молекул. В различных модификациях метода гибридизации нуклеиновых кислот используется подсоединение специфичных зондов, конъюгированных с субстратом или ферментом. Зонд — это небольшая часть ДНК, которую применяют для детекции комплементарной последовательности в реакционной цепи. В результате происходит усиление образующегося сигнала, регистрируемого тем или иным способом в ходе определения. Избираемые ДНК-зонды комплементарны изучаемому фрагменту.

Основные принципы зондовых технологий сходны с принципами дублирования наследственной информации в геноме организма. И те и другие основаны на следующих закономерностях: последовательность однонитевой цепи ДНК определяет после­довательность комплементарной цепи; в репликации ДНК двунитевые молекулы ДНК образуются под действием ДНК-полимераз — ферментов, которые считывают исходную матрицу и связывают нуклеотиды в растущие дочерние цепи.

Необходимыми условиями для технологий с использованием зондовых методов являются: денатурация исследуемой нуклеиновой кислоты для образования однонитевой последовательности нуклеиновой кислоты чаще всего путем обработки щелочью или нагреванием. Избираемые в качестве зондов олигонуклеотиды часто состоят из 15 — 20 оснований с точно определенной последова­тельностью.

Амплификация — это процесс производства множества копий ДНК из участка искомой ДНК или РНК. Выделяют технологии амплификации матрицы и технологии амплификации сигнала. Сре­ди различных технологий для амплификации фрагментов (матри­цы) ДНК и РНК следует выделить: полимеразную цепную реак­цию (ПЦР, PCR) и ее разновидности — модификации с исполь­зованием обратной транскриптазы, ПЦР — мультипраймерную, гнездовую, in situ, количественную лигазную цепную реакцию (LCR), амплификацию с вытеснением цепи (SDA); амплифика­цию с использованием транскрипции (NASBA, NFS, 3 SR). К тех­нологиям, применяемым для амплификации сигнала, относятся различные модификации метода гибридизации нуклеиновых кис­лот, при которых используют специфичные зонды: гибридизация с использованием разветвленных зондов (branched DNAtest); ДНК/ РНК-гибридный захват.