Иммуноэлектрофорез

Это двухэтапная процедура, при помощи которой макромолекулы (обычно белки) вначале разделяются с помощью электрофореза, а затем последовательно взаимодействуют с соответствующей антисывороткой. Присутствующей в среде-носителе. Могут быть различные варианты иммуноэлектрофореза:

Классический – на 1 этапе производят разделение белков в забуференном агаровом или агарозном геле, а затем латерально, параллельно разделенным компонентам прорезают щели, которые заполняют антисывороткой. Выдерживают в течение некоторого времени для диффузии компонентов (обычно ночь). Взаимодействие антиген-антитело обнаруживается по дугам преципитации. Метод позволяет выявить антигенный состав сложной смеси белков и идентифицировать отдельные компоненты смеси с помощью моноспецифических антисывороток. В клинике используется для типирования парапротеинов сыворотки и выявления белков Бенс-Джонса. Не относится к количественным методам исследования.

Иммуноэлектрофорез методом переноса

Основана на принципе классического иммуноэлектрофореза. Принцип тот же. Отличие – первичное электрофоретическое разделение производится на АЦ. Затем АЦ переносят на поверхность чашки с агаром и на расстоянии 3-5 мм параллельно зоне электрофоретического разделения помещают полоски фильтровальной бумаги, смоченные соответствующей антисывороткой. АГ и АТ диффундируют и образуют дуги преципитации. Преимущества – возможность более легкой идентификации отдельных белков (описанная методика уменьшает плотность дуг преципитации).

Электрофорез с последующей иммунофиксацией

Проводят электрофорез (чаще на целлюлозно-ацетатных мембранах), а затем идентифицируют белки с помощью антисывороток. Для этого пластину делят на сегменты. Которые затем погружают в антисыворотку. Обработанный сегмент (в нем образуется преципитат) прокрашивают (например, краситель Понсо С. или нигрозином). Метод удобен для определения белков Бенс-Джонса, парапротеинов в низкой концентрации.

2. Принцип хроматографических методов разделения веществ. Классификация хроматографического анализа. Ионообменная хроматография, аффинная хроматография, газовая хроматография, жидкостная хроматография под давлением (ВЭЖХ). Основные типы приборов, правила эксплуатации. Применение в клинико-диагностических лабораториях – 47 мин

Хроматография – один из наиболее избирательных методов разделения близких по химической структуре веществ. Основан на различном распределении составных частей исходной смеси между двумя фазами – подвижной и неподвижной. Процесс разделения складывается из многократных (повторяющихся сотни раз) актов перехода веществ из одной фазы в другую.

ХГ позволяет разделять вещества очень близкого строения, природные соединения, белки, нуклеиновые кислоты, и даже некоторые биологические объекты -,делают этот метод очень применимым и зачастую единственным в настоящее время. Особенно это касается белков и нуклеиновых кислот – их разделение хроматографическим методом очень точно позволяет выделять и анализировать белки очень сложного строения. В современных модификациях (например, ВЭЖХ) возможен анализ, идентификация и разделение очень малых количеств веществ (около 0,000001г) за очень короткое время – 15-20 минут.

Изначально метод позволял анализировать только окрашенные вещества, что и дало название методу – хроматографией, от греческих слов "хроматос" – окраска, "грамма" – считывание и "графия" – запись.

Теоретические основы и основные термины хроматографии.

Хроматограмма - представляет собой кривую зависимости концентрации, выходящих с потоком подвижной фазы из колонки ,от времени с начала разделения.

Для хроматографического анализа и особенно разделения важна форма зон (пиков) на хроматограмме. В идеале требуется , чтобы они были как можно более узкими и высокими и более удалены друг от друга, в этом случае легче будет провести анализ и он будет более точным.

Основные понятия хроматографии.

Сорбенты – вещества-поглотители – неподвижная фаза.

Элюент – раствор = подвижная фаза. При хроматографическом разделении компоненты смеси многократно распределяются между двумя несмешивающимися фазами – подвижной и неподвижной. Захваченные поверхностью твердого тела – сорбента молекулы могут переходить обратно в раствор – элюент, снова поглощаться и вновь растворяться, бесчисленное множество раз, меняя своё состояние.

В качестве подвижной фазы используется газ или жидкость. В качестве неподвижной, или стационарной фазы применяются твёрдые вещества или жидкости.

В зависимости от физического состояния применяемых фаз различают:

Подвижная фаза	Неподвижная фаза	Тип метода	Вид метода
Газ	Жидкость Твёрдое вещество	Газовая хроматография	Газожидкостная хроматография Газоадсорбционная хроматография
Жидкость	Жидкость Твёрдое вещество	Жидкостная хроматография	Жидкостно-жидкостная хроматография Жидкостно-адсорбционная хроматография

Сорбенты хроматографического анализа:

Сорбент является важнейшей частью хроматографической системы, именно от его характеристик и типа зависит возможность разделения веществ.

Основные параметры сорбента, имеющие значение для разделения веществ:

1.Размеры частиц. В классической колоночной хроматографии используются сорбенты с размерами частиц 30-200 мкм ,при высоте колонке 1 м. Однако главный недостаток крупно зернистых сорбентов – большая длина диффузии внутри зерен , в этом случае приходится применять небольшие скорости движения потока . В настоящее время всеп шире используют т.н. объемно-пористые сорбенты, в которых диаметр частиц = до 3—10 мкм. Несомненным достоинством объемно-пористых сорбентов является их большая емкость , что позволяет их использовать не только в аналитических целях, но и для препаративного разделения веществ.

2.Качества материала сорбентов. Используют самые разные вещества природного происхождения и синтетические – органические и неорганические полимеры. Прежде всего это сорбенты на основе целлюлозы, агарозы, окиси алюминия, силикагели.

3. Возможность химической модификации - введение каких—либо функциональных групп можно получить сорбент с требуемыми свойствами, сродством к определенным классам соединений. В частности так получают ионообменники, если функциональная группа ионогенна.

4. Развитость поверхности , размер пор на его поверхности.

5. Механическая прочность, химическая стойкость.

Одним из самых распространенных сорбентов является силикагель, или его многочисленные модификации. Это определяется тем ,что силикагель можно легко модифицировать, можно легко получать частицы с заданным размером частиц, размером пор, разной удельной поверхностью и т.д., к тому же сорбенты на основе силикагеля механически прочны и химически стойки. Силикагель чаще других сорбентов используют в нормально—фазовой хроматографии, благодаря взаимодействию сорбатов с полярными

Основа разделения:

Молекулы с разным составом или строением осаждаются (сорбируются) на твёрдой поверхности по-разному. Одни – прикрепляются немного прочнее, другие- несколько слабее. Одни – дольше находятся в связанном состоянии и меньше в растворе; другие – чуть дольше задерживаются в растворе и быстрее увлекаются потоком растворителя. Поэтому смесь различных веществ постепенно разделяется на составные части. И каждая такая часть сосредотачивается в своём слое – образуется хроматограмма. Каждая часть соответствует какому-то одному химическому соединению.

Механизмы разделения молекул в Хг системах:

• Неподвижная фаза физически поглощает (сорбирует) разделяемые вещества – адсорбционная ХГ

• Неподвижная фаза химически взаимодействует с разделяемыми веществами, в частности происходит обмен ионами – ионообменнаЯ ХГ

• Неподвижная фаза растворяет разделяемые вещества из раствора в несмешивающемся растворителе, то есть имеется разная растворимость компонентов смеси в неподвижной фазе – распредеелительная ХГ

• Неподвижная фаза имеет пористую структуру, затрудняющую диффузию молекул разделяемых веществ в этой фазе – эксклюзионная (молекулярно-ситовая) ХГ

• Разделяемые компоненты выпадают в осадок на твердой фазе – осадочная ХГ.

В качестве подвижной фазы используется газ или жидкость. В качестве неподвижной, или стационарной фазы применяются твёрдые вещества или жидкости.

По расположению фаз хроматографические системы подразделяются на две группы: плоскостные и колоночные. В колоночной сорбентом заполняют специальные трубки – колонки. Подвижная фаза движется внутри колонки благодаря перепаду давления. Разновидность колоночной хроматографии – капиллярная, когда тонкий слой сорбента наносится на внутренние стенки капиллярной трубки.

Плосткостная ХГ подразделяется на тонкослойную и бумажную. В тонкослойной тонкий слой гранулированного сорбента наносится на стеклянную или металлические пластинки. В случае бумажной ХГ используют специальную ХГ-бумагу. В плоскостной ХГ перемещение подвижной фазы происходит благодаря капиллярным силам.

Методы проявления хроматограмм:

Проявление – это процесс переноса разделяемых веществ подвижной фазой. Можно осуществить 3 основными способами: фронтальным анализом, вытеснением и элюированием.

Фронтальный анализ. Наиболее простой, т.к. проба сама служит подвижной фазой. Проба непрерывно добавляется в систему. Образование нескольких зон обусловлено различным сродством компонентов к неподвижной фазе. Передний край называют фронтом. Отсюда и название. В первой зоне находится только наименее удерживаемое вещество А, которое движется быстрее всего. Вторая зона содержит вещество А и Б. Третья зона смесь веществ – А, Б, В. Недостатки – нужны большие объемы проб, только вещество А получают в жидком виде.

Вытеснительный анализ. В сорбент вводится разделяемая смесь, а затем элюент. Основа метода – подвижная фаза обладает большим сродством к неподвижной фазе, чем разделяемое вещество. В результате подвижная фаза вытесняет и проталкивает все компоненты. Она вытесняет наиболее сильно сорбирующийся компонент В, который в свою очередь вытесняет вещество Б, а тот вытесняет наименее сорбирующийся компонент А. В отличие от фронтального анализа – все компонеты можно получить в индивидуальном виде.

Элюентный анализ – через слой сорбента непрерывно проходит поток элюента, периодически вводят разделяемое вещество в малом объеме. Разделение происходит за счет различного сройдства компонентов смеси к неподвижной фазе, и, следовательно, за счет разных скоростей их перемещения. В итоге зоны с компонентами будут постепенно образовывать отдельные участки, разделенные чистым элюентом. Метод исползуется наиболее широко, постепенно вытесняя все остальные.

Основные виды хроматографии.

К основным видам хроматографии относят адсорбционную, ионообменную, жидкостную, бумажную, тонкослойную, гель-фильтрационную и афинную хроматографию.

Адсорбционная хроматография. В этом случае разделение веществ осуществляется за счёт выборочной (селективной) адсорбции веществ на неподвижной фазе. Такая селективная адсорбция обусловлена сродством того или иного соединения к твёрдому адсорбенту (неподвижной фазе), а оно, в свою очередь, определяется полярными взаимодействиями их молекул. Поэтому часто хроматографию такого типа используют при анализе соединений, свойства которых определяются числом и типом полярных групп.

Ионообменная хроматография. В качестве неподвижной фазы используют ионообменные смолы как в колонках, так и в виде тонкого слоя на пластинке или бумаге.

Основан на способности некоторых твёрдых веществ – ионообменников обменивать ионы при контакте с растворами электролитов. В качестве ионообменников (ионитов) используют нерастворимые высокомолекулярные вещества природного или синтетического происхождения. А также неорганические ионообменники. Бывают двух типов анионоообменники (аниониты), катионоообменники – катиониты. Этот метод позволяет проводить разделение не только в аналитических целях, но и разделять вещества в более крупных масштабах, например при промышленном разделении веществ. Особенностью метода является то, что сорбент (ионнообменник) способен ионизироваться, отдавая подвижные ионы (H, Na) в подвижную фазу, при этом сам ионнообменник приобретает заряд.

Гель-фильтрация.

Она позволяет разделять молекулы в зависимости от их молекулярных масс. Разделение в этом методе основано на различной скорости диффузии молекул с разной молекулярной массой (различными размерами). Сорбентом в данном методе служит гель, точнее мелкие частицы, внутри пронизанные нитями (фибриллами). Диффузия внутрь этих частиц лимитируется размерами, а точнее подвижностью молекул которая зависит от их молекулярной массы. Чем меньше молекулы, тем легче они способны проникать вовнутрь гранул геля, соответственно более тяжелые частицы практически не проникают в гранулы, так как менее подвижны. Частицы попавшие внутрь гранул под действием диффузии движутся внутри и с равной вероятностью могут выйти наружу, но пространство внутри гранул геля пронизано нитями и молекулы претерпевают многочисленные столкновения с сетью фибрилл и способны надолго задерживаться внутри гранул. Таким образом, более легкие молекулы способны надолго задерживаться внутри гранул, и их скорость продвижения будет меньше скорости движения более тяжелых молекул.

Аффинная хроматография.

Она позволяет разделять отдельные ферменты ,белки и даже вирусы и простейшие биологические объекты .Особенностью данного вида хроматографии является то , что разделение основано на разного вида специфических взаимодействиях частиц подвижной фазы с сорбентом. Сорбентом в данном виде хроматографии служит гель типа агарозы к которому ковалентно привязаны подходящие лиганды ,им может быть субстрат какого-либо фермента ,Когда через такой сорбент пропускают подвижную фазу , то из нее будет сорбироваться только соответствующий фермент, он будет прочно связан с сорбентом, но его оттуда можно смыть избытком растворителя, или можно использовать закрепленный фермент, для непрерывного превращения молекул субстрата из подвижной фазы При модификации сорбента соответствующими антителами можно удерживать заданные вирусы, при модификации антигеном удерживать ген. Очевидно, что метод аффинной хроматографии очень высокоэффективен из-за селективности специфических взаимодействий и очень перспективен ,так как позволяет концентрировать биологические объекты , которые важны при производстве вакцин и сывороток.

Жидкостная хроматография ВЭЖХ (HPLC) используется для анализа, разделения и очистки синтетических полимеров, лекарственных препаратов, детергентов, белков, гормонов и др. биологически важных соединений. Использование высокочувствительных детекторов позволяет работать с очень малыми количествами веществ (10^-11-10^-9 г), что исключительно важно в биологических исследованиях.

Газовая хроматография ГХ (GC) применяется также для определения физико-химических характеристик индивидуальных соединений: теплоты адсорбции и растворения, энтальпии, энтропии, констант равновесия и комплексообразования; для твёрдых веществ этот метод позволяет измерить удельную поверхность, пористость, каталитическую активность.

Тонкослойная (ТСХ) и бумажная хроматография используются для анализа жиров, углеводов, белков и др. природных веществ и неорганических соединений.

Заключение. Ответы на вопросы- 5 минут

Зав. кафедрой клинической лабораторной диагностики

д.м.н. И.А.Новикова ____________________ /подпись/