Министерство здравоохранения Республики Беларусь Учреждение образования «Гомельский государственный медицинский университет»

Кафедра клинической лабораторной диагностики

Обсуждено на заседании кафедры

протокол № _________

«___» ______________200_ г.

Лекция

по клинической лабораторной диагностике

для студентов __3_ курса ____медико-диагностического ____ факультета

Тема: Методы фракционирования биологических жидкостей: электрофорез, хроматография

Время ___ 2 часа____

Учебные и воспитательные цели:

1. Сформировать представление об современных методах анализа состава веществ в клинико-диагностической лаборатории.

2. Рассмотреть принципы, методические и аналитические собенности методов электрофореза и хроматографии.

3. Ознакомить с наиболее распространенными методами разделения веществ в КДЛ.

ЛИТЕРАТУРА

1. Камышников В.С. Техника лабораторных работ. – Мн., ”Белорусская наука”, 2001 г., с. 249-251.

2. Камышников В.С. Методы клинических лабораторных исследований. – Мн., “Белорусская наука”, 2001 г., с. 423-426.

3. Преаналитический этап обеспечения качества лабораторных исследований / Под ред. В.В. Меньшикова. – Справочное пособие. – М.: ЛАБИНФОРМ, 1999 г. – с. 15-20.

4. Руководство по клинической лабораторной диагностике / Под ред. В.В. Меньшикова. –М.: Медицина, 1982 г., с. 17-27.

МАТЕРИАЛЬНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ

Мультимедийная презентация

РАСЧЕТ УЧЕБНОГО ВРЕМЕНИ

№ п/п	Перечень учебных вопросов	Время в минутах
	Вступление	3 мин
1.	Классификация методов электрофореза. Горизонтальный и вертикальный электрофорез, иммунный электрофорез, капиллярный электрофорез. Принципы методов, аналитическая процедура, преимущества и недостатки, оборудование для электрофореза и правила эксплуатации. Применение электрофореза в клинико-диагностических лабораториях.	35 мин
2.	Принцип хроматографических методов разделения веществ. Классификация хроматографического анализа. Ионообменная хроматография, аффинная хроматография, газовая хроматография, жидкостная хроматография под давлением (ВЭЖХ). Основные типы приборов, правила эксплуатации. Применение в клинико-диагностических лабораториях.	47 мин
	Заключение. Ответы на вопросы.	5 мин
Всего		90 минут

С О Д Е Р Ж А Н И Е

Вступление – 3 мин

В настоящее время в клинико-лабораторной практике широко используются способы предварительного выделения интересующих исследователя соединений, среди которых все большее применение находит электрофоретическое и хроматоргафическое фракционирование смеси веществ. Для количественного определения отдельных их компонентов (метаболитов) обычно применяются методы оптического анализа (абсорбционная фотометрия, флюориметрия, денситометрия и др.)

1. Классификация методов электрофореза. Горизонтальный и вертикальный электрофорез, иммунный электрофорез, капиллярный электрофорез. Принципы методов, аналитическая процедура, преимущества и недостатки, оборудование для электрофореза и правила эксплуатации. Применение электрофореза в клинико-диагностических лабораториях -35 мин

Как известно, молекулы белка имеют положительно и отрицательно заряженные группы. Суммарный заряд белковых молекул в значительной степени завист от рН буфера, в котором растворен белок. При щелочном рН белки выступают как анионы, а в кислой среде они приобретают свойства катионов. Причем, каждый белок характеризуется определенным значением рН, называемым изоэлектрической точкой данного белка. В этой точке белок не мигрирует, поскольку при этом значении рН для данного белка сбалансированы противоположно заряженные группы. Изоэлектрическая точка соответствует также минимальной растворимости белка. Таким образом, подвижность белка в электрическом поле зависит прежде всего от рН, (хотя дополнительное влияние оказывает электроэндосмос). Для хорошего передвижения белка в буфере рН буфера не должна приближаться к изоэлектрической точке этого белка. Ионная сила буфера обусловливает время, необходимое для миграции белка на заданное расстояние, причем увеличение ионной силы. Повышая степень разделения соответствующих электрофоретических зон, снижает скорость миграции.

Электрофорез осуществляется с помощью специальных носителей. Среда-носитель может оказывать влияние на условия электрофореза и тем самым изменять эффективность разделения. Носитель имеет собственный заряд. Электроэндосмос обусловлен суммарным отрицательным зарядом ионов. Входящих в состав носителя. Отрицательно заряженные ионы носителя способны перемещаться к аноду. В ответ возникает компенсаторный поток ионов буферного раствора к катоду, захватывающий с собой более слабо заряженные ионы белка. Если в качестве примре рассмотреть сыворотчные белки, мигрирующие в барбитуратном буфере при рН 8,6, то к аноду будут двигаться анионы с высоким зарядом (например, альбумин), тогда как молекулы с небольшим зарядом (например, гамма-глобулины, будут подвергаться электроэндоосмосу и приблизятся к катоду).

Носители, используемые для электрофореза:

В клинических лабораториях используют 2 типа носителей:

1. Ацетатцеллюлоза или агар и агароза. Это инертные материалы с порами больших размеров, которые не препятствуют миграции частиц. Уровень электроэндосмоса варьирует в зависимости от конкретной среды-носителя. Так, и ацететцеллюлоза и агар характеризуются выраженным электроэндосмосом. Имеются коммерческие препараты агарозы с электроэндосмосом щирокого спектра – от низкого до самого высокого. Степень электроэндосмоса выбирают в соответствии с условиями проводимого разделения.

2. Крахмальные и акриламидные гели. Эти носители содержат поры, сравнимые по размерам с размерами белковых молекул. Это обстоятельство обеспечивает комбинирование эффекта молекулярного сита с электрофоретическим разделением, основанным на распределении заряда. Электрофореграммы, нолученные на таких носителях содержат больше фракций. Чем на ацетатцеллюлозе, агаре и агарозе.

Применение электрофореза в клинике:

Электрофорез на АЦ или агарозу следует проводить в тех случаях, когда имеются основания предполагать, что определение характеристик белков плазмы поможет получить полезную клиническую информацию. Основные клинические ситуации, в которых рекомендуется электрофорез сыворотки:

1. Абсолютное показание, необходимое для установления диагноза. Когда никакая другая процедура не обеспечит получение эквивалентной информации также быстро и доступно – парапротеинемии, гемоглобинопатии, иммунодефицитные состояния с нарушением продукции иммуноглобулинов – агаммаглоблинемия.

2. Клинически полезное в сочетании с другими исследованиями – заболевания печени, нефротический синдром, злокачественные заболевания, коллагенозы.

3. Наблюдение и лечение заболевания, при которых происходят существенные нарушения в составе белков плазмы (примечание – необходимо использовать постоянно одну и ту же методику).

4. Скрининг. При популяционных обследованиях на выявление аномальных белков или дефицита отдельных белков плазмы.

Электрофоретическое разделение белков плазмы становится ценным методом лишь в том случае, если используется удачная и правильно выполняемая методика. Она должна обеспечивать разделение пяти основных фракций: альбумина, α1-, α2-, β- и γ-глобулина, а также небольшой зоны преальбумина.

Анализ электрофореграмм:

Для выявления разделенных белков применяют разнообразные методы.

• Прямое исследование методами ультрафиолетовой и инфракрасной спектроскопии

• Осаждение неспецифическим агентом с последующим окрашиванием образца

• Специфические реакции фермент-субстрат, приводящие к образованию окрашенного нерастворимого продукта.

• Осаждение макромолекул при помощи специфических антител. Образующийся нерастворимый преципитат исследуется либо прямым способом либо полсдующим окрашиванием красителем (иммуноэлектрофорез).