1.Микроскопические методы анализа в лаборатории
2. Микроскопы
Микроскоп (от греч. mikros — малый, skopeo — смотрю) — это прибор, позволяющий получать увеличенное изображение объектов и структур, недоступных глазу человека.
В медицинских и биологических исследованиях применяют методы световой и электронной микроскопии.
3. Световая и электронная микроскопия
Световые микроскопы могут увеличивать объект размером от 0,5 мкм с разрешением элементов объекта до 0,1 мкм более чем в 1 800 раз. Для освещения используют естественный свет или искусственные источники света.
Электронная микроскопия делает возможным исследование объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа (менее 0,2 мкм) и применяется для изучения вирусов, бактериофагов, тонкого строения микроорганизмов и других субмикроскопических объектов и макромолекулярных структур. Обеспечивает увеличение объекта в 20 000 раз.
4. Виды микроскопических приборов
Биологические микроскопы (проходящего света)
Инвертированные биологические микроскопы (инвертированные микроскопы проходящего света)
Люминесцентные микроскопы
Поляризационные микроскопы проходящего света
Стереоскоптические микроскопы
Анализаторы изображения.
По степени сложности каждую группу микроскопов делят на учебные; рутинные; рабочие; лабораторные; исследовательские.
5. Составные части микроскопа
Основные функциональные части:
механическая, оптическая, осветительная система
Механическая часть микроскопа:
Штатив, в состав которого входят основание и тубусодержатель.
Предметный столик, на котором располагают, крепят и фиксируют в определенном положении объект наблюдения. Закреплен на специальном кронштейне. Предметные столики могут быть подвижными и неподвижными. Неподвижные столики применяют в самых простейших моделях микроскопов. При оснащении микроскопов подвижными столиками возможно механическое перемещение или управление от электродвигателя (сканирующий).
6.Схема устройства микроскопа
7. Оптическая часть микроскопа
Обеспечивает его основную функцию, создает увеличенное изображение объекта с достаточной степенью достоверности по форме, соотношению размеров и цвету.
Основные оптические элементы микроскопа - объектив, окуляр, конденсор.
Вспомогательные элементы – осветительная система, дополнительные насадки
По количеству объективов микроскопы могут быть
монокулярные
бинокулярные
тринокулярные
В некоторых технологиях микроскопирования существует также необходимость выполнения работ непосредственно под микроскопом. Используются объективы с большим рабочим расстоянием (свободное расстояние между объективом и объектом).
8. Иммерсионные объективы
необходимое требование – использование иммерсионной жидкости - необходима для повышения разрешающей способности микроскопа; в соответствии с технологией микроскопирования; повышения видимости за счет увеличения разности показателя преломления среды и объекта; увеличения глубины просматриваемого слоя, который зависит от показателя преломления среды.
Типы иммерсионных жидкостей:
-
масляная (МИ/Oil),
-
водная (ВИ/W)
-
глицериновая (ГИ/Glyc) (в основном применяют в ультрафиолетовой микроскопии).
9. Окуляры
Окуляр — обращенная к глазу часть оптического прибора, предназначенная для рассматривания с некоторым увеличением изображения, созданного объективом прибора. Служат для построения микроскопического изображения на сетчатке глаза наблюдателя. Они играют роль лупы, дополнительно увеличивающей изображение, созданное объективом. В общем виде состоят из двух групп линз: глазной и полевой (ближайшей к плоскости изображения), в которой объектив строит изображение рассматриваемого объекта.
Одним из направлений в современном производстве микроскопов является использование в них оптики без хроматической разности увеличения (ХРУ = 0 %). Этот принцип связан с развитием систем анализа изображения, в которых от собственно изображения требуется четкость контура для его распознавания и затем обработки с помощью компьютерных программ (измерение площади, периметра, оптической плотности и др.).
Окуляры обеспечивают работу оператора, имеющего нормальное зрение или пользующегося очками. Если микроскопические исследования требуют проведения точных измерений, то конструкция окуляров таких микроскопов предусматривает расположение внутри них шкал и сеток. Эти окуляры изготавливают с минимальным искажением изображения на краях поля зрения.
10. Осветительная система микроскопа
Осветительная система — это система линз, диафрагм и зеркал (при необходимости), обеспечивающая равномерное освещение объекта и полное заполнение апертуры объектива.
Включает:
источник света (естественный или искусственный);
коллектор — оптическая система, проецирующая нить лампы в плоскость апертурной диафрагмы конденсора. Вблизи коллектора расположена полевая диафрагма микроскопа.
конденсор — оптическая система, которая проецирует полевую диафрагму коллектора в плоскость предмета, предназначена для увеличения количества света, поступающего в микроскоп. В микроскопах проходящего света конденсор расположен между объектом (предметным столиком) и источником света (коллектор, зеркало). В микроскопах отраженного света роль конденсора выполняет объектив.
11. Источники света при световой микроскопии
Используется естественный свет либо искусственное освещение (лампы накаливания, галогенные, ртутные).
В отечественных старых световых микроскопах используется лампа накаливания РН8-20-1, а в современных микроскопах отечественного и зарубежного производства - в основном галогеновые лампы, чаще всего фирмы «OSRAM» (Германия), с напряжением 6 В, мощностью 20 или 30 Вт. В исследовательских микроскопах применяют более мощные лампы — напряжением 12 В и мощностью 50 или 100 Вт.
12. Световые микроскопы
Подразделяют:
микроскопы плоского поля - обеспечивают воспроизведение объекта в двухмерном пространстве — двухмерное плоское изображение. Можно просматривать объекты толщиной от 10 до 0,1 мм, просматриваемый слой по высоте от 1,0 до 0,001 мм.
стереоскопические (объемное или трехмерное изображение объекта. Позволяют рассматривать прозрачные и полупрозрачные объекты, объекты большого размера (от 100 до 1 мм). Просматриваемый слой по высоте (глубине) — от 50 до 0,5 мм
Микроскопы проходящего света плоского поля называют в отечественной литературе биологическими микроскопами.
13. Инвертированные микроскопы
Инвертированные микроскопы (перевернутое строение схемы микроскопа) сконструированы таким образом, что наблюдательная часть микроскопа (бинокулярная насадка с окулярами) расположена снизу объекта. Оптическая система расположена ниже предметного столика, а источник света — выше. Это обеспечивает возможность свободных микроманипуляций с объектом наблюдения. Используется для работы с культурами клеток.
14. Типы микроскопии в зависимости от принципов построения изображения
Микроскопы светлого поля — на светлом фоне наблюдается более темное изображение объекта.
Микроскопы с методом темного поля - применяют освещение под таким углом, чтобы световые лучи от осветителя не попадали в объектив. Наблюдаемые объекты становятся при этом видимыми как светящиеся точки на темном поле или контур объекта имеет ярко блестящий вид.
Микроскопы с методом фазового контраста (фазово-контрастная микроскопия) позволяют с максимальной степенью визуализации и детальности наблюдать на сером фоне более темное «объемное» изображение объекта, окруженное по контуру светлой полосой.