5.Принцип метода иммуноферментного анализа (ифа). Приборы и оборудование для иммуноферментного анализа. Реагенты и наборы для ифа. Основные этапы ифа, оценка результатов –

Используют иммунореагенты, меченые ферментами. Наиболее широко применяется твердофазный ИФА, В качестве твердой фазы используют – полистироловые или поливиниловые планшеты или шарики, на которых адсорбированы АГ или АТ.

Последовательность реакции:

Известный АГ адсорбируют в лунках вносят исследуемую сыворотку промывают для удаления несвязавшихся белков вносят антииммуноглобулиновые АТ, меченые ферментом (обычно пероксидазой) после инкубации и отмывания добавляют специфичный для фермента субстрат (перекись водорода) и хромоген (о-фенилендиамин) для регистрации конечных продуктов расщепления субстрата. Учет реакции по изменению интенсивности окраски раствора.

Методы ИФА обладают очень высокой чувствительностью. В методике Гомогенного Иммуноферментного Анализа ((ГИФА) Homogenus Enzyme Immu- noAssay ( HEIA)) в cоставе реагентов присутвует синтетический антиген, меченный ферментом ( глюкозо-6-фосфат дегидрогеназой ) и антитела к нему. Активность этого фермента стимулируется, либо ингибируется при связывании синтетического антигена с антителами ГИФА-является конкурентным тестом. Так, в ходе реакции, синтетический антиген, входящий в состав реагентов конкурирует с исследуемым антигеном пробы за места связывания лимитированного количества, также входящего в состав реагентов, антител. Активность фермента пересчитывается при помощи калибровочной кривой в концентрацию исследуемого антигена пробы.

• Область применения.

Для детекции концентраций лекарственных препаратов (теофиллин фенитоин), скрининга концентраций наркотических веществ.

• Диапазон детекции.

От 10-4 до 10-9 моль\л.

• Радиальная иммунодифузия

Технология качественной радиальной иммунодифузи по Манчини ((РИД) предусматривает применение в качестве матрицы гель, смешанный с соответствующей антисывороткой. Исследуемая проба вносится в лунки этого геля и диффундирует в нём по окружности. В соответствии с кривой Heldelberger, сначала растворимый иммунокомплекс не заметно окружает место внесения пробы пациента. Концентрация внесённого в лунку антигена снижается по мере увеличения радиуса его диффузии в геле, и формирования нерастворимых иммунных комплексов. В точке эквивалентности Ag-At формируется линия преципитации с чёткими границами. Концентрация исследуемого антигена устанавливается при помощи калибровочной линии, полученной при помощи стандартных разведений, либо непосредственно, используя фактор, в случае применения стандартизированных пластинок.

• Область применения.

Для детекции концентраций специфических белков, таких как трансферрин, гаоглобин, ,аполип- опротеины, альбумин.

• Диапазон детекции.

От 10-3 до 10-7 моль\л.

• Преимущества технологии.

1. Простой метод, не требующий больших денежных расходов на преобретение и сервисное обслуживание измерительной аппаратуры.

• Недостатки технологии.

1. Очень продолжительный процесс полной преципитации, более 24 часов.

2. Методика не может быть адаптирована для клинико-химических автоанализаторов.

3. Субъективная оценка результатов теста сотрудниками лаборатории.

4. Трудоёмкий в выполнении тест.

5. Ограниченная чуствительность теста.

• Гетерогенный иммуноанализ.

Технология гетерогенного иммуноанализа отличается от технологии гомогенного иммуноанализа тем, что первая предусматривает использование твёрдой фазы в качестве составной части иммунологической реакции.

• Твёрдая фаза.

В качестве твёрдой фазы фазы применяются различые материалы те .пробирки, микроплашки, шарики, магнитные частицы и др. Все они связаны либо с антителами, либо с антигенами (те. входящими в состав реагентов. Прим. Автора Перевода.)

• Принцип детекции.

Технология гетерогенного иммуноанализа предусматривает использование в качестве системы детекции различные метки те. радиоактивные изотопы (РИА),ферменты (ТИФА), флюорофоры (ЛИА).

• “ Cэндвич тесты”.(“Sandwich tests”).

Концентрации субстратов с высокой молекулярной массой, являющихся достаточно большими для связывания их по крайней мере с двумя антителами, определяют обычно при помощи так называемого “Cэндвич тэста”. Технология этого теста предусматривает использование двух антител, одно из которых свяано с твёрдой фазой, а другоё содержит ферментную метку. Тест может быть выполнен в виде либо одностадийного (одновременная инкубация твёрдой фазы, исследуемого антигена и ферментной метки),либо в виде двухстадийного ( те. последовательная инкубация твёрдой фазы, исследуемого антигена и инкубация с ферментной меткой) исследования. Схема одностадийного исследования ( анализа) подробно показана на схеме.

• Область применения.

Определение концентрации белковых гормонов, таких как ТТГ, опухолевых маркёров (КЭА),а также определение инфекционных маркёров ( НвSАg, и др.)

• Диапазон детекции.

От 10-8 до 10-13 моль\л.

• Конкурентные тесты.

Если молекула исследуемого вещества (антигена) достаточно мала для связывания с ней двух молекул антител, применяется технология конкурентного тестирования. В этом случае используются два принципа:

1) Антитела, связанные с твёрдой фазов:

Исследуемое вещество (антиген) пробы крови и входящий в состав реагентов антиген, меченный ферментной меткой, конкурируют между собой за связывание с ограниченным количеством антител, связанных с твёрдой фазой. В результате этого, количество меченого антигена, связавшегося с этими антителами обратно пропорционально концентрации исследуемого антигена пробы.

2)Антиген, связанный с твёрдой фазой.

Синтетический антиген, входящий в состав реагентов, адсорбированный на твёрдой фазе и исследуемый антиген пробы конкурируют между собой за связывание с ограниченным количеством меченных ферментной меткой антител. Тогда, чем выше в пробе пациента концентрация исследуемого антигена, тем ниже количество меченых антител связывается с адсорбированными на твёрдой фазе антигенами.

• Область применения.

Для детекции веществ, содержащихся в пробе в низких концентрациях, таких как кортизол, тироксин(Т4),лекарственные вещества(дигоксин, и др.)

• Диапазон детекции.

От 10-6 до 10-12 моль\л.

• Преймущества технологии.

1. Высокая чуствительность метода.

2. Низкая интерференция метода.

• Недостатки технологии.

1. Очень трудоёмкая при ручном выполнении, но всё-таки менее трудоёмкая чем технология

“ Cэндвич теста”.

Заключение. Ответы на вопросы- 5 минут

Зав. кафедрой клинической лабораторной диагностики

д.м.н. И.А.Новикова ____________________ /подпись/