3. Сатурационный анализ: принцип, методология и технология выполнения радиоиммунологического и иммунорадиометрического анализа – 6 мин

«Сатурационный» (насыщающий) анализ — вид исследования, основывающийся на конкурентном связывании некоторых веществ (лигандов) с анализируемым веществом биологического происхождения и его меченым аналогом, добавленным извне. Они конкурируют за лиганд, который используется в таком количестве, чтобы его связывающая способность полностью насытилась. Очевидно, что, чем больше в пробе определяемого вещества, тем меньше связывается меченое вещество. После этого отделяют комплекс от свободных ингредиентов и подсчитывают количество метки, определяемой как в составе комплекса, так вне его.

В качестве лигандов используются три группы веществ биологического происхождения: 1) антитела, 2) специфические транспортные белки, 3) рецепторные белки органов-мишеней.

Важной разновидностью сатурационного анализа является радионуклидный, базирующийся на применении соединения с радиоактивной меткой. В зависимости от природы связывающего акцептора принято различать:

а) истинно радиоиммунологические методы, в которых в качестве связывающего компонента (лиганда) используются специфические к исследуемому веществу антитела;

б) методы белковоконкурентного анализа, где связывающим реагентом являются специфические белки сыворотки крови (транскортин, трансферрин, тироксинсвязывающий глобулин; глобулин, связывающий тестостерон, и т.д.). Их способность к комплексированию с транспортными белками сохраняется и в пробирке;

в) методы радиорецепторного анализа, в которых в качестве акцепторов используются тканевые белки.

4. Основные виды радиоиммунного анализа (РИА). Реагенты и наборы для РИА. Расчет результатов исследований – 15 мин

Различают следующие основные виды радинуклидного анализа:

1. Радиоиммунологический анализ. Основан на иммунохимической реакции антигена со специфическим антителом: проводится in vitro в присутствии подходящего меченного радионуклидом соединения. Определяемое вещество является антигеном, а радиоактивным индикатором служит меченый антиген.

2. Иммунорадиометрический анализ отличается от радиоиммунологического анализа тем, что в качестве меченого реагента используется антитело, а антиген (как калибровочный, так и анализируемый) является нерадиоактивным компонентом реакции.

3. Радиоконкурентный анализ базируется на конкурентном взаимодействии между исследуемым веществом, его меченым аналогом и связывающим компонентом, в качестве которого используются специфические белки плазмы (тироксинсвязывающий белок при определении тироксина и др.).

4. Радиорецепторный анализ — метод, при котором в качестве специфически связывающего компонента реакции применяется тканевый рецептор (т.е. клеточный связывающий белок), а в качестве радиоиндикатора — меченый лиганд.

5. Радиоэнзиматический анализ — способ, в котором в качестве связывающего реагента для определяемого вещества и его меченого производного (радиоиндикатора) используется специфический фермент. Характерной особенностью радиоэнзиматичес-кого анализа является его весьма высокая чувствительность.

Преимущества радиоиммунологического анализа перед биохимическими методами исследования следующие:

1) большая чувствительность, позволяющая определять ничтожно малые количества вещества (10^-15 — 10^-12 г/л), что обусловлено использованием радиометрических методов регистрации;

2).высокая специфичность, связанная с применением принципа иммунологических (антиген—антитело) реакций;

3).большая точность и удовлетворительная воспроизводимость метода;

4) простота выполнения и значительная пропускная способность;

5) отсутствие лучевой нагрузки на организм обследуемого, поскольку исследования проводятся in vitro.

Методы сатурационного анализа позволяют производить количественное определение в биологических жидкостях (плазме, сыворотке, моче, слюне и др.) любого химического вещества, к которому можно получить специфические антитела.

В методах сатурационного анализа в качестве основных реагентов используют:

1) выделенный из биологического материала и тщательно очищенный (или полученный путем химического синтеза) немеченый антиген (например, гормон). Он используется для построения калибровочной кривой, а также для получения меченого антигена и иммунизации животных с целью выделения специфических антисывороток;

2) меченый (по йоду или водороду) антиген (гормон с высокой удельной активностью — 100 мкюри/мг);

3) антисыворотку, содержащую специфические антитела (иммуноглобулины) к исследуемому антигену.

Радиоиммунологическое определение состоит из четырех основных этапов: инкубации, разделения, радиометрического исследования и учета результатов. Инкубация осуществляется при различных температурных режимах. Длительность ее зависит от молекулярной массы реагирующих антигенов и температуры, при которой происходит реакция. Для антигенов с малой молекулярной массой (тироксин, трийодтиронин, кортизол) время инкубации составляет от 30 мини до 2 ч; для антигенов с большой молекулярной массой (соматотропин, тиротропин и др.) — 24 ч. Если инкубация проводится при комнатной температуре, этот процесс сокращается, при низкой температуре (4°С) — удлиняется.

На втором этапе комплекс «антиген—антитело» отделяется от непрореагировавших компонентов. Образующийся преципитат отделяют центрифугированием или микрофильтрацией и подсчитывают радиоактивность надосадочной жидкости. Радиометрическое исследование преципитата или надосадочной жидкости. Производят с использованием сцинтидляционных счетчиков.

Учет результатов. Наряду с оценкой радиоактивности опытных и стандартных проб проводят радиометрию контролей общей активности — Т (меченый антиген) и связывания — В (меченый антиген и разведенная антисыворотка)..

В настоящее время радиоиммунологический микроанализ широко используется для ранней диагностики эндокринных, онкологических, аллергических, инфекционных и других заболеваний, а также для контроля за эффективностью проводимого лечения.