2. Методы преципитации в геле – радиальная иммунодиффузия, встречная иммунодиффузия, ракетный электрофорез, иммуноэлектрофорез. Методология, оборудование, учет результатов – 20 мин

Реакции АГ:АТ в системе in vitro могут сопровождаться возникновением нескольких феноменов: преципитации, агглютинации, лизиса. Внешние проявления реакции зависят от физико-химических свойств АГ (размеры, физическое состояние), класса и вида АТ (полные или неполные), условий постановки реакции (РН, консистенция среды, температура), а также от количественного соотношения АГ и АТ.

Поливалентность АГ и АТ обеспечивает возникновение видимых невооруженным глазом агрегатов. Это происходит следующим образом: к образовавшемуся комплексу АГ-АТ последовательно присоединяются другие молекулы АГ и АТ, реагируя со свободными детерминантами. При этом формируются сетевые структуры, которые превращаются в агрегаты, выпадающие в осадок. Такие агрегаты образуются только при соединении АГ с полными АТ. Неполные (моновалентные) АТ не вызывают образования сетевых структур и крупных агрегатов. Поэтому для проявления таких реакций необходимы специальные методы (например, в реакции Кумбса).

Серологические реакции, благодаря высокой специфичности и чувствительности, применяют для выявления и количественного определения АГ и АТ. Результат реакции выражают в титрах – максимальное разведение сыворотки или антигена, при котором еще наблюдается реакция. Для выявления неизвестного АГ используют диагностические иммунные антисыворотки, которые получают путем многократной иммунизации лабораторных животных соответствующим АГ.

Обнаружение АТ проводят с использованием известных антигенов – иммунодиагностикумов. Это может быть взвесь убитых микробов или выделенные различными способами АГ.

Реакция преципитации основана на образовании преципитата при смешивании АГ с АТ в эквивалентных или близких к эквивалентным концентрациях. В реакции участвуют растворимые АГ, которые в возрастающих концентрациях добавляют к раствору АТ. Образуются ИК, которые видны в виде преципитатов, то есть происходит помутнение прозрачных жидкостей или выпадение осадка. Количество ИК вначале возрастает, затем падает. Поэтому кривая преципитации имеет 3 зоны.

• зона избытка АТ – количество АГ недостаточно для того, чтобы в реакцию вступили все АТ. В супернатанте определяются свободные АТ.

• зона эквивалентности – количество антигена достаточно для связывания и осаждения всех имеющихся АТ. Свободные АТ и АГ в супернатанте отсутствуют.

• зона избытка антигена – количество АГ превышает количество, необходимое для связывания всех АТ, что ведет к снижению содержания АТ в преципитате. Это обусловлено солюбилизацией комплексов АГ-АТ. Выраженность этого феномена варьирует в зависимости от типа АТ и вида организма, от которого получены АТ.

Реакцию преципитации можно проводить в жидкой и плотной среде (агаре или геле).

При проведении реакции преципитации в агаре в разные лунки агара помещают АГ и АТ, которые диффундируют навстречу друг другу и при взаимодействии образуют комплекс, который осаждается в виде линии преципитации.

При проведении реакции в геле можно дифференцировать реакции, обусловленные различными АТ. Для этого применяется реакция – двойная иммунодиффузия.

Однако некоторые смеси антигенов могут быть слишком сложны для разделения просто путем диффузии и преципитации. Для анализа таких смесей разработан иммуноэлектрофорез. На 1 этапе производят разделения по заряду, а на 2 – реакцию преципитации.

Для количественной оценки концентрации реагирующих компонентов используется метод простой радиальной иммунодиффузии. Антиген диффундирует в гель и образует с АТ растворимые комплексы (при избытке АГ). Комплексы продолжают диффундировать, связывая все большее количество АТ, пока не будет достигнут точка эквивалентности, в которой происходит осаждение комплексов с образованием кольца. Диаметр кольца пропорционален концентрации АГ.

Реакции агглютинации. В них принимают участие АГ в виде частиц, которые склеиваются АТ и выпадают в осадок.

В зависимости от вида используемого иммунодиагностикума различают реакцию микробной агглютинации, гемагглютинации, латекс-агглютинации, коагглютинации и т.д.

Реакции агглютинации более чувствительны, чем преципитации и позволяют выявлять АТ в концентрации менее 1 мкг/мл.

Реакция прямой (активной) агглютинации клеток используется при определении групп крови. Для этого применяют стандартные сыворотки крови доноров, содержащие известные анти-А или анти-В антитела. Проба на совместимость крови.

В клиниках применяют реакцию агглютинации лейкоцитов, тромбоцитов и других клеток для выявления аутоантител. а также определения АГ на этих клетках.

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации - антиген предварительно адсорбируют на эритроцитах (или другом корпускулярном носителе, например, латексе, полистироле, тогда реакция называется агглютинацией). В присутствии специфических АТ к данному АГ нагруженные эритроциты склеиваются и выпадают в осадок.

Прямая и непрямая антииммуноглобулиновые реакции Кумбса

используют для выявления неполных (неагглютинирующих) АТ, которые образуются при различных заболеваниях (резус-конфликте, аутоиммунных процессах, некоторых инфекционных заболеваниях), Для постановки реакции необходима антииммуноглобулиновая сыворотка, которая получается путем иммунизации кролика иммуноглобулинами человека. Такая сыворотка содержит полные АТ против Иг.

Прямая реакция: к отмытым эритроцитам больного добавляют антииммуноглобулиновую сыворотку. При наличии на эритроцитах неполных антител – агглютинация. Используется при резус-конфликте, гемолитической анемии.

Непрямая реакция: выявляет свободные антиэритроцитарные АТ в сыворотке крови больного. К этой сыворотке добавляют отмытые эритроциты донора 1 группы, инкубируют при 37 30 минут, отмывают, а затем добавляют антииммуноглобулиновую сыворотку. При наличии в сыворотке больного антиэритроцитарных АТ – агглютинация.

Реакция связывания комплемента. Суть реакции в том, что образующиеся при взаимодействии Аг и АТ ИК связывают комплемент. Для обнаружения связывания комплемента используют дополнительную индикаторную гемолитическую систему. Эта система состоит из ЭБ, обработанных гемолитической антисывороткой. В присутствии комплемента происходит лизис эритроцитов. При формировании комплексов АГ-АТ лизиса эритроцитов в индикаторной гемолитической системе не происходит (РСК отрицательная), при отсутствии ИК – лизис происходит (РСК положительная).