2. Применение диагностических полосок для общеклинического анализа мочи. – 15 мин

Техника анализа. Эти полоски используют для массового «си-тевого» (от слова «просеивание», т.е. пропускание через скринин-говое «сито») исследования большого числа образцов мочи. На рис. 7.1 изображены схема диагностической полоски «Combur 10 Test» и устройство одной из зон — для обнаружения крови (гемоглобина) в моче.

Если на полоске объединены несколько реакционных зон, содержащих реагенты для анализа различных аналитов, их наклеивают на общую полимерную подложку. Бумажная подложка, содержащая абсорбент, предотвращает интерференцию и удаляет избыток мочи. Чувствительная реакционная зона защищена от контакта, загрязнений и царапин специальной нейлоновой сеткой, которая также обеспечивает быстрое и однородное проникновение мочи и равномерное развитие окраски реакционной зоны, что существенно повышает аналитическую надежность полоски.

В целях предотвращения влияния интерференции содержащей-rl ся в моче аскорбиновой кислоты в полоске, например «Combuw 10 Test» верхний слой зоны для определения гемоглобина импрегнируется йодатом, который окисляет аскорбиновую кислоту.' Чтобы избежать воздействия влаги на реагенты тест-полосок, контейнеры для их хранения оснащают осушителем, который располагают в крышке контейнера или пенала.

Некоторые аналиты мочи при отсутствии патологии имеют, значения, близкие к нулю. Для них важной характеристикой является порог обнаружения (чувствительность метода). В основе методов «сухой химии» для анализа мочи лежат цветные реакции, приводящие к изменению окраски тестовой зоны полоски. В зависимости от химических свойств определяемого аналита используют как обычные химические реакции, так и ферментативные (например, глюкозооксидазная реакция для анализа глюкозы в моче, или количества лейкоцитов в моче на основе исследования активности их собственной эстеразы).

Результат с диагностической полоски может считываться визуально, изменение окраски тестовой зоны сопоставляется с цветной шкалой, обычно нанесенной на пенал, в котором хранятся полоски. При этом важно, чтобы диагностически значимые изменения показателя мочи вызывали визуально заметные изменения окраски. Для объективизации измерения изменения окраски полоски используют отражательные фотометры — анализаторы мочи. Анализ может быть автоматизирован.

Полоски для исследования одного аналита называются монотестами, или монофункциональными (например, полоски «УРИБЕЛ» отечественного предприятия «Биосенсор АН» или «альбуФАН» фирмы «PLIVA-Lachema a.s.», Чехия) предназначены для исследования альбумина в моче, «глюкоФАН» — глюкозы. Полоски для одновременного анализа нескольких аналитов называются политестами, или полифункциональными.

Химические принципы, лежащие в основе реакций на полосках различных изготовителей для одного и того же аналита близки, хотя существуют отличия в составе реактивов, что влияет и на различие окраски тестовой зоны, чувствительность и подверженность ее воздействию различных факторов, что, как правило, подробно описано в инструкциях к тест-полоскам.

Выполнение анализа и оценка результатов исследования. Визуальная оценка результатов по цветным шкалам, нанесенным на контейнеры для хранения полосок, а также при полуколичествен-ном определении на отражательных фотометрах может быть выражена как в единицах концентрации, так и в виде градации результатов: отрицательные — «-», сомнительные — «±», положительные — «+», «++», «+++», а для некоторых компонентов (белок, глюкоза, относительная плотность, уробилиноген) —«++++». Учитывая, что некоторые полоски могут быть использованы не только для визуальной оценки, но и для полуколичественного определения указанных компонентов на отражательных фотометрах для мочи, в них предусмотрены так называемые компенсационные зоны. Последние не импрегнированы реактивами и представляют собой своего рода «холостые пробы», постановка которых необходима для приборной компенсации на-тивного окрашивания мочи при обнаружении некоторых компонентов.

При практическом выполнении тестов на диагностических полосках для мочи следует внимательно изучить инструкцию и проводить анализ в соответствии с правилами, изложенными в ней.

1. Для исследования используют свежесобранную мочу, хранившуюся до анализа не более двух часов.

1. Мочу тщательно перемешивают, не центрифугируют.

2. Далее нужно изъять из пенала, не прикасаясь руками к тестовым зонам, необходимое для анализа количество полосок. Пеналследует быстро закрыть крышкой.

3. Держа полоску за конец, свободный от тестовых зон, плавно погрузить полоску в пробирку или другой сосуд с мочой, не делая резких и перемешивающих движений, что может приводить к вымыванию реагентов из тестовых зон. Включить секундомер.

4. Спустя 1 — 2 с (время указано в инструкции) полоску извлекают из мочи, ребром полоски касаясь сосуда, в котором онанаходится, удаляют избыток мочи. Этой операции следует уделять особое внимание. Лишнее количество мочи в виде капли на тестовой зоне может привести к завышенным результатам. Присутствие мочи в промежутках между зонами вызывает смешивание реагентов соседних зон, что вызывает нарушение протекания реакций и ошибочные результаты.

5. После удаления избытка мочи полоску следует держать горизонтально для исключения перекрестного загрязнения реактивами из прилегающих зон.

6. Спустя 30 —60 с (60—120 с — для лейкоцитов) после погружения полоски в мочу сравнить окраску тестовых зон с окраской соответствующих зон цветной шкалы на пенале и зарегистрировать результат.

2. Технологии «сухих тестов» для исследований крови и других биологических жидкостей – 20 мин

Особенности биохимического анализа крови. Ранее всего были разработаны методы «сухой химии» для определения глюкозы в крови. В настоящее время исследование как глюкозы, так и различных других аналитов в крови может быть выполнено на диагностических полосках, многослойных пластиковых элементах — слайдах, биосенсорах, с помощью специальных картриджей, содержащих сухие реактивы.

Принцип метода исследования глюкозы с помощью диагностических полосок и слайдов практически совпадает с методом, используемым для определения глюкозы в моче — это специфический глюкозооксидазный — пероксидазный метод с окислением хромогена — индикатора (о-толидина, тетраметилбензидина) и образованием окрашенного соединения, изменяющего окраску тестовой зоны.

Для оценки концентрации глюкозы в исследуемом образце окраску тестовой зоны визуально сравнивают с окраской зон цветной шкалы, нанесенной на пенал для хранения полосок, либо полоску или слайд помещают в отражательный фотометр для измерения результата. Изменение окраски пропорционально концентрации глюкозы. Структура и состав элементов диагностической полоски для исследования глюкозы, как и других аналитов в крови, отличается от таковых в диагностических полосках для мочи, поскольку различаются состав и вязкость этих биожидкостей.

Отличаются соответственно виды и состав контрольных и калибровочных материалов. При использовании глюкометров после нанесения капли капиллярной (или венозной) крови врач, лаборант или сам пациент, строго соблюдая время, указанное в инструкции, не удаляя каплю крови, помещает полоску в прибор.

«Сухие иммунохимические тесты». Под понятием «сухая иммунохимия» объединяют аналитические устройства, в которых иммобилизованы в сухой форме реактивы для проведения гомогенного и гетерогенного иммуноанализа в пористом матриксе с применением моноклональных и поликлональных антител для специфического связывания с исследуемым аналитом. Это могут быть диагностические полоски или тест-кассеты. Наиболее часто используют два вида этих устройств: «проточный тип» и тесты, основанные на латеральном, или поперечном, токе на диагностических полосках и кассетах.

В первом случае пористый матрикс образует реакционную зону и действует как твердая фаза в варианте гетерогенного иммуноанализа. Антитело ковалентно связано с поверхностью пористого матрикса. При нанесении пробы на матрикс содержащийся в ней аналит связывается с иммобилизованным антителом. Добавление второго меченого антитела формирует «сэндвич» и привязывает метку к месту иммобилизации первого антитела. Оценку результата по окрашенной метке выполняют визуально. В качестве метки при этом можно использовать окрашенные частицы латекса, коллоидального золота.

При постановке иммуноферментных реакций окраска выявляется после добавления к связанному с искомым аналитом антитела, конъюгированного с ферментом, соответствующего субстрата. На этом принципе основано обнаружение и полуколичественное определение ряда компонентов (Д-димера, С-реактивного белка) на карточках «NycoCard». Карточка отмечена названием компонента, для которого она предназначена, и имеет шесть лунок (каждая для одного анализа), содержащих пористую мембрану с иммобилизованными антителами к исследуемому аналиту.

В случае превышения концентрации аналита в крови или сыворотке, нанесенной в лунку, порогового значения (например, 10 мг/л для С-реактивного белка) аналит связывается с иммобилизованными на мембране моноклональными антителами, специфичными к одному его эпитопу. После добавления конъюгата моноклональных антител с частицами коллоидального золота (размером 3 — 5 нм), специфично связывающихся с другим эпитопом молекулы аналита, образуется «сэндвич», в котором реализуется оптический эффект связанного в нем коллоидального золота. После промывки ячейка приобретает различные оттенки красного цвета. Окрашивание сравнивают с прилагаемой к данному тесту полуколичественной шкалой. Возможно количественное определение аналита с помощью отражательного фотометра, имеющего оригинальную конструкцию: ячейку в карточке не помещают в кюветную камеру ридера, а на нее накладывают соединенный с ним детектор.

Концентрацию важного для диагностики нарушений в системе гемостаза Д-димера можно определить аналогичным способом в диапазоне от 0,5 мг/л до 8,0 г/л. На этом принципе основано несколько «сухих» тест-систем для обнаружения антител к антигенам вирусов HIV1/HIV2 или раздельного обнаружения антител к этим вирусам.

Другой тип иммуноаналитических устройств — тесты, основанные на латеральном, или поперечном, токе на диагностических полосках и кассетах. В них нанесенная на тестовую зону проба с искомым аналитом выступает в роли растворителя и в связи с хроматографическими свойствами носителя движется по участку пористого матрикса, на котором в высушенной форме расположены необходимые для соответствующей иммунохимической реакции реактивы (антигены, меченые и другие антитела и т.д.).

Эти тесты, как правило, выполняют в один этап, анализ завершается в течение несколько минут. Подобно другим вариантам «сухих» технологий в данном имеются как монотесты, предназначенные для обнаружения одного аналита, так и политесты для выявления целой панели аналитов. Так, панель «Ml» двухэтапного иммунохроматографического теста для выявления инфаркта миокарда насчитывает четыре маркера повреждения сердечной мышцы: миоглобин, легкие цепи миозина, КК MB и тропонин I, для каждого из которых в случае положительной реакции обнаруживается отдельная окрашенная полоса.

«Сухие тесты» для обнаружения «скрытой крови» в кале. В зависимости от принципа, можно выделить две основные группы методов обнаружения «скрытой крови» — гемоглобина — в кале на основе «сухих» тестов: тесты, использующие псевдопероксидазные свойства гемоглобина (реакция с гваяковой смолой или ортотолидином) и иммунохимические тесты.

Все тесты на «скрытую кровь» в кале выполняют только специалисты, имеюще медицинское образование. «Сухие» тесты с гваяковой смолой основаны на модификации реакции Грегора. Гемоглобин, обладая пероксидазными свойствами, в присутствии пероксида водорода катализирует превращение фенольных соединений в гваяковой смоле в хиноны, имеющие голубую окраску. В состав набора реактивов для этих тестов входят: упакованная в непроницаемую для бактерий извне бумажную или картонную карточку (например, тест «Haemoccult» или «Hexagon OBScreen») хроматографическая бумага; картонные или другие шпатели; реактивы — активаторы реакции (раствор цитрата в этаноле); раствор пероксида водорода в этаноле, развивающий реакцию.

«Сухие» тесты с гваяковой смолой обладают некоторыми недостатками: невысокой чувствительностью и специфичностью (влияние диеты — пероксидаз, содержащихся в пище, в необработанных фруктах и овощах, ложноположительная реакция наблюдается при приеме аскорбиновой кислоты, препаратов железа). Ряд лекарств — ацетилсалициловая кислота, индометацин, фенилбутазон, кортикостероиды и резерпин могут вызвать кровотечение из желудочно-кишечного тракта. Следовательно, за три дня до исследования необходимо назначить особую диету и отменить лекарства.

Иммунохимические тесты для обнаружения «скрытой крови» в кале основаны на иммунологической реакции гемоглобина человека с моноклональными антителами, меченым лигандом, обеспечивающим визуализацию положительной реакции. Чаще всего используют иммунохроматографические тесты в кассетах с поперечным током реакционной смеси через пористый матрикс.