1. Способ со стандартными сыворотками

Определение групп крови требует выдерживания определенных условий и строгого порядка в выполнении для исключения ошибки. Используют стандратные сыворотки 1, 2,3 группы и для дополнительного контроля стандартную сыворотку 4 . Учет реакции по наличию или отсутствию( 1 гр) агглютинации. Если агглютинация во всех 3-х пробах (4 гр) – проводят дополнительное контрольное исследование для исключения неспецифической агглютинации со стандартной сывороткой 4 гр (агглютинации быть не должно), тогда точно 4 гр.

2.Перекрестный способ

Дополнительно к стандартным сывороткам берут стандартные эритроциты гр. 1,2,3. (изготавливаются станциями переливания крови в консервированном виде) Их устанавливают в штатив в определенном порядке - слева направо 1,2,3.

Наиболее частые причины ошибок:

Технические:

• Недоброкачественные сыворотки или эритроциты

• Перепутывание проб с исследуемой кровью

• Ошибочное расположение или ошибочный порядок нанесения стандартных сывороток или эритроцитов

• Нарушение соотношения сыворотка:эритроциты

• Неоптимальный температурный режим (менее 15 – холодовая агглютинация, боле 25 – замедление агглютинации)

• Несоблюдение времени реакции 9менее 5 минут)

• Недобавление физ раствора после 3 минуты

• Неиспользование контрольной реакции с сывороткой 4 гр

• Взаимное перемешивание сывороток пипетками

Биологические вариации:

• Наличие группы А2 или А2В – дают мелкие, медленно появляющиеся агглютинаты. Реакция может быть ошибочно учтена как отрицательная. Т.е. гр. А2 регистрируется как 1 или 3. Риск ошибки увеличивается при наслоении технических погрешностей.

• Неспецифическая агглютинация исследуемых эритроцитов. Может наблюдаться при патологических состояниях с диспротеинемией и интоксикацией (опухоли, цирроз, лейкоз, сепсис и др.). Неспецифическую агглютинацию выявляет конроль с сывороткой 4 группы. В этих случаях необходимо вновь определить группу крови перекрестным методом в капли, где наблюдается агглютинация можно добавить подогретый физраствор. При необходимости можно отмыть исследуемые эритроциты теплым физраствором и вновь определить группу крови.

• Ошибки, связанные с наличием экстраагглютининов. В сыворотке крови лиц групп А2 (II) и А2В (IV) приблизительно в 1% случаев обнаруживаются антитела к А1 антигену – α1. Это осложняет определение группы крови перекрестным методом, так как сыворотка таких лиц агглютинирует стандартные эритроциты А(II). То есть проявляет себя как сыворотка О (I).

• При некоторых заболеваниях наблюдается снижение агглютинабельности эритроцитов, особенно группы А(II)

• При иммунодефицитных состояниях у стариков наблюдается снижение уровня групповых агглютининов.

Во всех случаях получения сомнительного результата определение групп должно производиться повторно перекрестным методом с использованием сывороток более высокой активности.

4. Определение групп крови с помощью цоликлоНов

Изготавливаются с помощью гибридомной технологии из асцитной жидкости мышей. Выпускаются в жидкой форме во флаконах емкостью 5-10 мл. Помечены: антиА- красного цвета, антиВ- синего, антиАВ – бесцветный. В качестве консерванта применяется азид натрия – 0,1%. Срок хранения 2 года при температуре 2-8С. Вскрытый флакон можно хранить в течение 1 месяца при температуре 2-8С.

Определение групп производится в крови, взятой с консервантом, или без консерванта. Метод прямой гемагглютинации на плоскости. Методика та же – большая капля ЦОЛИКЛОНа – рядом малая капля крови, смешивают. Наблюдают втечение 3-х минут (агглютинация начинается через 3-5 с).

3. Система антигенов резус, формирование, антигенность, иммуногенность, разновидности. Патофизиологические механизмы формирования конфликта по резус-антигенам. Профилактика резус-конфликта – 22 мин.

Открыты в 1939 г. Ландщтейнером и Винером. Существует 6 антигенов, для обозначения которых используются 2 номенклатуры параллельно. Номенклатура Винера: Rh⁰, rh¹, rh^″, Hr⁰, hr¹, hr^″,и номенклатура Фишера и Рейса: соответственно D,C,Е,d,c,e.

Резус-антигены - это гликолипиды, располагающиеся только в оболочках эритроцитов. Их образование кодируется 3 генами, каждый из которых может быть в двух вариантах (аллелях) – сильном или слабом D – d, C-c, E-e. Наследование осуществляется кодоминантно. Антигены DCE называются основные резус-антигены, так как имеют наиболее важное значение.

Антиген D считается основным в системе резус, так как является из других резус-антигенов наиболее иммуногенным, хотя и уступает по иммуногенности групповым АГ. Именно D‑антиген назван стандартным резус-антигеном. При определении Rh у реципиентов принимают во внимание именно этот антиген: D-Rh+, d – Rh^-. В европе 85-86% - Rh+, 14-15% - Rh^-. Среди жителей Азии процент резусположительных лиц выше – до 99%.

К донорам крови подход строже: резус-отрицательный донор не должен содержать в эритроцитах ни одного из основных (D,C,E) антигенов резус, то есть должен иметь формулу d,c,e, так как к этим антигенам могут вырабатываться АТ у людей, не содержащих С и Е в эритроцитах. В противном случае он идет как донор резус-положительный, а как рецириент – резус-отрицательный.

Иммуногенность D-Rh в 20 раз выше, чем у других Rh – АГ, хотя и уступает иммуногенности АГ групп крови. Переливание Rh⁺D эритроцитов вызывает образование специфических аллоантител у 80% D-Rh^- индивидов. Плотность расположения D-RhАГ на эритроците – 10.000-30.000 молекул.

Гемолитическая болезнь новорожденных может развиться и по другим резус-антигенам.

Существуют слабые разновидности антигенов резус. Например, D^u. Он встречается от 1 до 3% резус-положительных людей. Обычно они дают мелкую и слабую агглютинацию. Тактика: если это больной (реципиент), он регистрируется как резус- отрицательный, а если донор – как резус-положительный. Не допускается переливание крови с антигеном D^u резус-отрицательным реципиентам.

Формируются резус- антигены на 6-10 неделе внутриутробного периода. Их сила в это время такая же, как у взрослых, а иногда даже превышает ее.

При тяжелых интоксикациях может наблюдаться маскирование резус-антигенов, это преходяще.

Антитела системы резус – в норме отсутствуют. Появляются у резус-отрицательных лиц в ответ на попадание резус-антигенов:

• беременность Rh^- -женщины Rh+ плодом;

• переливание Rh+ крови Rh^- реципиенту.

В организме сенсибилизированных лиц антитела к резус-антигенам сохраняются несколько лет, а иногда на протяжении всей жизни. В боьшинстве случаев титр антирезусных антител постепенно снижается, но опять резко возрастает при повторном попадании резус-положительной крови.

Аните Rh антитела могут полные и неполные. Полные (чаще М) – виновники посттрансфузионных реакций и в патогенезе гемолитической болезни новорожденных не участвуют, так как не проходят через плаценту.

Неполные АТ (чаще G и А) принимают участие в развитии ГБН, агрессивны, легко проходят через плаценту и повреждают плод.

Для проявления агглютинации под действием неполных антител требуются особые условия: повышенная температура, коллоидная среда. Антитела класса А могут быть в молозиве. Имеют клиническое значение при гемотрансфузиях и несовместимой по Rh беременности.

Механизм следующий: при первой беременности во время родов происходит сенсибилизация матери эритроцитами плода с формированием ИгG АТ к этим АГ. При второй беременности сенсибилизированной резусотрицательной матери резус-положительным плодом эти АТ проникают через плаценту в кровь плода и вызывают разрушение его эритроцитов.

Частота – приблизительно 10% от общего количества родо, хотя по расчетам теоретически больше. Причины:

• Первая беременность редко приводит, обычно 2 или 3

• Некоторые женщины не вырабатывают достаточного количества АТ, и в низких титрах они не оказывают существенного влияния

• риск ГБН вследствие резус-несовместимости уменьшается при одновременном несовпадении по групповым антигенам

Вероятно, в организме резусотрицательной матери резусположительные клетки разрушаются быстрее, поскольку они несовместимы и по антигенам АВО. В результате резусположительные эритроциты плода не успевают сенсибилизировать мать.

Профилактика резус-конфликта:

Используется специфическая профилактика человеческим антирезусным ИгG/ Метод используется в клинике с 1963г. Не более чем через 72часа (лучше в первые 2 суток) после родов резус-отрицательной матери вводят анти-Д-сыворотку с целью разрушить попавшие в ее кровь эритроциты –резусположительного плода прежде, чем они смогут оказать сенсибилизирующее действие.

Метод используется также при угрозе прерывания беременности либо преждевременных родов в случае опасности возникновения резус-конфликта. Вводится в/в 150-300 мкг препарта. Если резус-сенсибилизация уже произошла (аборт, гемотрансфузия), то профилактика окажется неэффективной. Эффективность данного метода профилактики – 93-97%. То есть из 100 новорожденных с угрозой ГБН развивается лишь у 3-7 младенцев.

4. Принципы определения резус-принадлежности крови. Трактовка результатов – 10 мин

Осуществляется с помощью стандартных антирезусных сывороток в реакции гемагглютинации. Стандартные сыворотки приготавливают из крови резус-отрицательных лиц, сенсибилизированных к резус-фактору многокртаными переливаниями крови или беременностями, а также из крови лиц, подвергнутых искусственной иммунизации к антигену D. Рекомендуется использовать одновременно 2 серии стандартных антирезус-сывороток.

При каждом исследовании для проверки специфичности и активности сыворотки обязательно ставятся контроли. Используют 2 контроля:

• стандартные резус-положительные эритроциты 1 группы или той же группы, что и исследуемая кровь.

• стандартные резус-отрицательные эритроциты, обязательно той же группы, что и исследуемая кровь.

Учет результатов: если результаты с двумя сериями стандартных сывороток совпадают, то после проведения контролей (отрицательная с резус-отрицательными эритроцитами, положительная – с резусположительными) – результат считают истинным.

Если при определении резуса получен слабый или сомнительный результат. Необходимо повторно исследовать кровь этого же лица с другими сериями антирезусной сыворотки (и желательно включить сыворотку, содержащую полные антитела). Если при этом все сыворотки, содержащие неполные АТ опять дадут слабую или сомнительную реакция, а с полными АТ реакция будет отрицательная, следовательно эти эритроциты содержат слабую разновидность антигена резус, т.н. фактор D^u. В этих случаях резуспринадлежность крови больного или беременной женщины указывают как резус-отрицательную. Если обследуется донор. Он фиксируется как резус-положительный.

5. Система антигенов Kel, формирование, антигенность, иммуногенность, разновидности. Антитела анти-KEL, роль в патологии – 5 мин

Формируются на 6-7 неделе внутриутробного развития, причем выражены так же хорошо, как и у взрослых. У взрослых выявляются на зрелых эритроцитах, а также на эритроидных клетках ранних стадий эритропоэза. Начиная с уровня эритробластов. KEL-подобный антиген обнаружен в некоторых штаммах кишечной палочки, микробактериях, стрептококках, энтерококках. Наибольшее значение в практической медицине имеет антиген KEL-1, т.к. является наиболее иммуногенным (хотя его иммунизирующая активность несколько меньше, чем у резуса). KEL-1 содержится в эритроцитах около 10% людей, 90% являются KEL-отрицательными.

Антител анти-KEL появляются в результате беременности или трансфузий эритроцитов, очень редко встречаются естественные. Считается, что причиной появления иммунных антител являются перекрестные браки между представителями разных рас. Которые увеличивают уровень сенсибилизации населения.

АнтиKEL антитела могут появиться уже при первой беременности или гемотрансфузии. Чаще всего они являются неполными антителами класса G.

Определение: метод конглютинации с 10% желатином, агглютинация в солевой среде непрямая проба Кумбса.

6. Антигены гистосовместимости I и II классов. Биохимические свойства. Экспрессия на клетках. Наследование. Биологическое значение антигенов гистосовместимости. Роль HLA в посттрансфузионных реакциях – 15 мин.

Главный комплекс гистосовместимости (МНС, у человека – HLA) – это комплекс генов, которые сами по себе или через кодируемые ими продукты обеспечивают генетический контроль иммунного ответа и взаимодействие различных клеточных элементов, реализующих иммунный ответ. Гены этого комплекса контролируют синтез тканевых антигенов. Получил свое название на основании того, что белки, кодируемые этими генами, были впервые выявлены при отторжении трансплантата, то есть при тканевой несовместимости. В настоящее время установлено, что истинная роль этих белков – служить маркерами идентичности на поверхности различных клеток, с которыми лимфоциты взаимодействуют через собственные рецепторы в иммунной реакции, то есть осуществлять контроль за различными функциональными проявлениями иммунной реактивности. У человека главный комплекс гистосовместимости известен как HLA (human leucocyte antigens) и расположен практически во всех ядросодержащих клетках организма и тромбоцитов. Наибольшее их количество представлено на лимфоцитах. У всех клеток данного индивидуума система HLA тождественна. Первооткрыватель системы HLA – французский иммуногематолог лауреат Нобелевской премии Ж.Доссе.

HLA –гены у человека располагаются в 6 хромосоме. и сконцентрированы в 7 областях (локусах). В иммунологических процессах наиболее существенна роль HLA антигенов I и II классов.

Биохимически антигены гистосовместимости относятся к гликопротеидам. Построены HLA подобно мономерам ИгG.

Наследование HLA-генов осуществляется по кодоминантному типу, то есть у потомства в одинаковой мере экспрессируются HLA-антигены, кодируемые генами соответствующего локуса обоих родителей.

Биологическая функция:

1.HLA обеспечивает развитие иммунного ответа на антигены, осуществляя их Распознавание. С нарушениями их функций в настоящее время связывают некоторые формы иммунодефицитных состояний человека, в основе которых лежит потеря возможности экспрессии HLA на иммунокомпетентных клетках. Это является одним из патогенетических звеньев развития онкологических заболеваний.

2. .HLA осуществляет регуляцию иммунного ответа. Наибольшее значение в этом процессе играют антигены HLA-DR, относящиеся к антигенам гистосовместимости 2 класса. Поэтому в настоящее время принято считать HLA-DR гены – генами иммунного ответа.

3. HLA– играет важную роль в регуляции активности ЕК. Показано, что взаимодействие ЕК с HLA в период их дифференцировки исключает возможность повреждения ЕК собственных «нормальных» клеток.

4. HLA обеспечивает взаимодействие не только между иммунокомпетентными, но и другими клетками организма, и тем самым – его функциональную целостность.

5. HLA лежит в основе реакций отторжения при трансплантации. Для предотвращения реакции отторжения производится HLA-типирование, то есть подбор донора и реципиента.

Трансфузии крови и ее компонентов также способствуют развитию сенсибилизации антигенами гистосовместимости. При этом происходит образование изоиммунных антител. Их возниконовение отмечено, начиная с 6 гемотрансфузий. При 20 гемотрансфузиях около 50% больных оказываются сенсибилизированными к антигенам гистосовместимости. После 50 гемотрансфузий – практически все. Трансфузии крови и ее компонентов больным с анти-HLA-антителами сопровождается повышением температуры тела, ознобом, одышкой, сердцебиением, стеснением в груди, слабостью, появляющимся в первые 1-2 часа после переливания несовместимых лейкоцитов и тромбоцитов. Характерной чертой таких трансфузионных реакций является практически полное отсутствие гемолиза при весьма выраженных клинических проявлений. При этом наблюдается состояние рефрактерности к проводимой терапии компонентами крови ввиду быстрого разрушения анителами перелитых лейкоцитов и тромбоцитов. Негемолитические трансфузионные реакции являются основной причиной, затрудняющей проведение многократных повторных переливаний крови, лейкоцитарной и тромбоцитарной массы, правильно подобранных по АВО, резус и другим антигенам. Сила трансфузионной реакции в значительной мере определяется количеством антител. Обычно тяжелые трансфузионные реакции отмечаются при титре лейкоагглютининов 1:32 и выше. Основным направлением предупрежедения таких реакций является учет антигенов гистосовместимости. Удобно для этих целей использование крови, обедненной лейкоцитами и тромбоцитами, которые несут на своей поверхности антигены гистосовместимости. Широкое применение получили переливания отмытых эритроцитов (возможность удаления плазменных антигенов) и криоконсервированной крови.

6. HLA участие в репродукции человека.

Заключение. Ответы на вопросы- 5 минут

Зав. кафедрой клинической лабораторной

диагностики

д.м.н. И.А.Новикова ____________________ /подпись/