Лекции / Методы фракционирования биологических жидкостей

Методы фракционирования биологических жидкостей: электрофорез, хроматография

План лекции:

1. Классификация методов электрофореза. Горизонтальный и вертикальный электрофорез, иммунный электрофорез, капиллярный электрофорез. Принципы методов, аналитическая процедура, преимущества и недостатки, оборудование для электрофореза и правила эксплуатации. Применение электрофореза в клинико-диагностических лабораториях.

2. Принцип хроматографических методов разделения веществ. Классификация хроматографического анализа. Ионообменная хроматография, аффинная хроматография, газовая хроматография, жидкостная хроматография под давлением (ВЭЖХ). Основные типы приборов, правила эксплуатации. Применение в клинико-диагностических лабораториях..

Слайд 2 Хроматография

Хроматография – метод разделения близких по химической структуре веществ, основаный на различном распределении составных частей исходной смеси между двумя фазами – подвижной и неподвижной. Процесс разделения складывается из многократных (повторяющихся сотни раз) актов перехода веществ из одной фазы в другую.

Метод разработал Михаил Семёнович Цвет в 1903г., который обнаружил разную сорбируемость пигментов хлорофилла на оксиде алюминия, и как следствие разную скорость продвижения по колонке, заполненной им.

Изначально метод позволял анализировать только окрашенные вещества, что и дало название методу – хроматографией, от греческих слов "хроматос" – окраска, "грамма" – считывание и "графия" – запись.

Слайд 3 Основные понятия хроматографии

При хроматографическом разделении компоненты смеси многократно распределяются между двумя несмешивающимися фазами – подвижной и неподвижной.

Подвижная фаза = Элюент – жидкость или газ.

Неподвижная фаза = сорбент – твердое вещество или жидкость.

Вещества, входящие в состав смеси, осаждаются (сорбируются) на сорбенте по-разному: одни – прочнее, другие- слабее. Одни – дольше находятся в связанном состоянии и меньше в растворе; другие – наоборот → смесь постепенно разделяется на составные части. Каждая часть сосредотачивается в своём слое – образуется хроматограмма. Каждая часть соответствует какому-то одному химическому соединению.

Слайд 4 Основные виды хроматографии

В зависимости от природы взаимодействия, обусловливающего распределение компонентов между элюентом и неподвижной фазой, различают хроматографию:

• Адсорбционная

• Распределительная

• Ионообменная

• Эксклюзионная (молекулярно-ситовая): гель-проникающая и гель-фильтрация

• Осадочная

Слайд 5 Виды хроматографии (продолжение)

Адсорбционная хроматография основана на различии сорбируемости разделяемых веществ адсорбентом (твёрдое тело с развитой поверхностью).

Распределительная хроматография основана на разной растворимости компонентов смеси в неподвижной фазе и элюенте

Ионообменная хроматография основана на различии констант ионообменного равновесия между неподвижной фазой (ионитом) и компонентами разделяемой смеси

Эксклюзионная (молекулярно-ситовая) хроматография основана на разной проницаемости молекул компонентов в неподвижную фазу (высокопористый неионогенный гель). Гель-проникающая: элюент - неводный растворитель, гель-фильтрация: элюент - вода.

Осадочная хроматография основана на различной способности разделяемых компонентов выпадать в осадок на твёрдой неподвижной фазе.

Слайд 6 Виды хроматографии (продолжение)

В зависимости от агрегатного состояния элюента и неподвижной фазы:

Подвижная фаза	Неподвижная фаза	Тип метода	Вид метода
Газ	Жидкость Твёрдое вещество	Газовая хроматография	Газожидкостная хроматография Газоадсорбционная хроматография
Жидкость	Жидкость Твёрдое вещество	Жидкостная хроматография	Жидкостно-жидкостная хроматография Жидкостно-адсорбционная хроматография

Слайд 7 Виды хроматографии (продолжение)

В зависимости от устройства:

• Колоночная – сорбентом заполняют специальные трубки- колонки, а подвижная фаза движется внутри колонки, благодаря перепаду давления. Разновидность - капиллярная (тонкий слой сорбента наносится на стенки капиллярной трубки).

• Плоскостная – перемещение подвижной фазы происходит благодаря капиллярным силам. Делится на тонкослойную и бумажную. В тонкослойной хроматографии тонкий слой гранулированного сорбента или пористая плёнка наносится на стеклянную или металлическую пластинки; при бумажной хроматографии используют специальную хроматографическую бумагу.

Слайд Приборы для хроматографического анализа

Приборы для хроматографического анализа - хроматографы.

Позволяют производить анализ веществ и препаративное разделение смесей веществ.

Качественный хроматографический анализ - осуществляют по времени выделения детектируемого вещества. При колоночной хроматографии определяют время от момента ввода пробы до выхода каждого компонента из колонки при данной температуре и при использовании определённого элюента. При бумажной хроматографиии - по скорости перемещения пятен веществ относительно скорости растворителя.

Количественный анализ - определяют высоты или площади хроматографических пиков с учётом коэффициентов чувствительности используемого детектирующего устройства к анализируемым веществам (при колоночной) или измеряют интенсивность окраски вещества (при бумажной).

Слайд Сорбенты хроматографического анализа

Основные параметры сорбента, имеющие значение для разделения веществ:

Размеры частиц

Качество материала сорбента

Возможность химической модификации сорбента

Слайд Влияние размера частиц сорбента на качество хроматографии

Крупные частицы (30-200 мкм при высоте колонки 1 м) – малая скорость разделения вследствие большой длины диффузии внутри зерен.

Усовершенствование: 1) поверхностно-пористые сорбенты - на неактивное ядро (стеклянный шарик) d 30 мкм наносят тонкий слой сорбента 1-2 мкм. Положительные стороны - небольшое сопротивление потоку. Недостаток - малая сорбционная емкость, так как в значительной степени состоят из неактивного материала.

2) объемно-пористые сорбенты – малый диаметр частиц (3—10 мкм). Достоинство - большая сорбционная емкость (можно использовать для препаративного разделения веществ). Недостаток – значительное сопротивление потоку (необходимость применять давление 50- 400 атм).

Слайд Материалы для хроматографии

В качестве материалов сорбентов используют вещества природного происхождения и синтетические – органические и неорганические полимеры.

Самые распространенные сорбенты - на основе целлюлозы, агарозы, окиси алюминия, силикагели.

Химическая модификация сорбента - введение каких-либо функциональных групп. При этом можно получить сорбент с требуемыми свойствами, сродством к определенным классам соединений. Пример: силикагель можно легко модифицировать, получая частицы с заданным размером частиц, размером пор, разной удельной поверхностью и т.д.

Газовая хроматография

Применяется для определения состава лекарственных препаратов, примесей вредных веществ в воздухе, воде, почве, промышленных продуктах; а также в криминалистике и т.д. Позволяет разделить несколько см³ газа или мг жидких (твёрдых) веществ; время анализа от нескольких секунд до нескольких часов.

Для газо-адсорбционного варианта хроматографии в качестве сорбента (частицы диаметром 0,1-0,5 мм)используют силикагели, алюмогели, молекулярные сита, пористые полимеры и др. сорбенты с удельной поверхностью 5-500 м²/г.

Для газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ) сорбент готовят нанесением жидкости в виде плёнки (высококипящие углеводороды, сложные эфиры, силоксаны и др.) толщиной несколько мкм на твёрдый носитель с удельной поверхностью 0,5-5 м²/г и более.

Слайд Жидкостная хроматография ВЭЖХ

Используется для анализа, разделения и очистки синтетических полимеров, лекарственных препаратов, детергентов, белков, гормонов и др. биологически важных соединений. Использование высокочувствительных детекторов позволяет работать с очень малыми количествами веществ (10^-11-10^-9 г). Часто применяется молекулярно-ситовая хроматография и хроматография по сродству (основана на способности молекул биологических веществ избирательно связываться друг с другом).

Слайд Ионообменная хроматография

Широко распространенный вариант жидкостной хроматографии.

Используется в аналитических целях и для препаративного разделения веществ, позволяет отделять и разделять заряженные частицы - аминокислоты, белки, карбоновые кислоты. Основа метода – использование в качестве сорбента ионообменника – полимера, модифицированного введением ионогенных групп. Если матрица имеет отрицательный заряд - катионо-обменник, положительный - анионообменник. Разделение основано на электростатическом взаимодействии ионов подвижной фазы с неподвижными ионогенными группами ионообменника.

Катионо- и анионо-обменники бывают сильными и слабыми. Сильные ионизированы во всем интервале pH , а слабые лишь в определенном интервал. Ионизацией слабых ионообменников можно управлять, меняя pH среды.

Слайд Гель-фильтрация

Позволяет разделять молекулы в зависимости от их молекулярных масс. Очень эффективен для разделения белков и других высоко-молекулярных соединений.

Основа метода - различная скорость диффузии молекул с разной молекулярной массой (различными размерами).

Сорбент - гель (мелкие частицы, внутри пронизанные нитями (фибриллами). Диффузия внутрь этих частиц лимитируется подвижностью молекул, которая зависит от их молекулярной массы. Мелкие молекулы легко проникают вовнутрь гранул геля и способны надолго задерживаться внутри гранул, а крупные - не проникают в гранулы и быстро выходят из колонки. Т.е. скорость продвижения мелких молекул будет меньше скорости движения более тяжелых молекул.

Слайд Сорбенты гель фильтрации

Полидекстрановые гели:

• Сефадекс – гидрофильный гель, выпускается в сухом виде, имеет маркировку G и номер, означающий пористость матрицы (количество воды в мл, которое связывает 10 грамм сухого геля).

• Сефакрил – поставляется в набухшем виде (густая водная суспензия). Достоинства - более высокая (по сравнению с сефадексом) жесткость частиц (можно вести хроматографический процесс при больших скоростях), более химически стойки. Выпускают 5 типов с маркировкой S ( от S-200 до S-1000 ).

Гели агарозы:

• Сефароза – поставляется в виде суспензии. Гели её довольно жесткие, но менее чем у сефакрила.

Слайд Аффинная хроматография

Позволяет разделять отдельные ферменты ,белки, вирусы.

Основа метода - специфические взаимодействия частиц подвижной фазы с сорбентом.

Сорбент - гель типа агарозы, к которому ковалентно привязаны подходящие лиганды (например, антитела или субстрат какого-либо фермента). При прохождении через сорбент подвижной фазы из нее будет сорбироваться только соответствующий фермент (или антиген), который прочно связывается с сорбентом. Удаление фиксированного вещества - избытком растворителя.

Слайд Аффинная хроматография

Рис

Слайд Электрофорез

Процесс разделения заряженных частиц в электрическом поле. Явление электрофореза обнаружено Рейсом в 1809 г. Применение в клинико-диагностических лабораториях – с 50-х г. XX в.

Теоретические основы (на примере белка): молекулы белка имеют положительно и отрицательно заряженные группы. Суммарный заряд молекул зависит от рН буфера, в котором растворен белок. При щелочном рН белки выступают как анионы, а в кислой среде - каккатионы (движутся, соответственно, к аноду или катоду). Каждый белок характеризуется определенным значением рН, при котором он не мигрирует, поскольку при этом значении сбалансированы противоположно заряженные группы - изоэлектрическая точка. Изменяя значения рН буфера можно производить разделение белков в электрическом поле.

Применение: разделение белков, липопротеинов, аминокислот (высоковольтный э/ф).

Слайд Носители, используемые для электрофореза

Среда-носитель может оказывать влияние на условия электрофореза, изменяя эффективность разделения, так как имеет собственный заряд (процесс электроэндосмоса).

В клинических лабораториях используют 2 типа носителей:

1. Ацетатцеллюлоза, агар, агароза. Это инертные материалы с порами больших размеров, которые не препятствуют миграции частиц. Степень электроэндосмоса разная, выбирают в соответствии с условиями проводимого разделения.

2. Крахмальные и акриламидные гели. Эти носители содержат поры, сравнимые по размерам с размерами белковых молекул, что обеспечивает комбинирование эффекта молекулярного сита с электрофоретическим разделением, основанным на распределении заряда. Электрофореграммы, нолученные на таких носителях содержат больше фракций, чем на ацетатцеллюлозе, агаре и агарозе.

Слайд Применение электрофореза в клинике

Основные клинические ситуации, в которых рекомендуется электрофорез белков сыворотки:

1. Абсолютное показание, необходимое для установления диагноза (никакая другая процедура не обеспечит получение эквивалентной информации также быстро и доступно) – парапротеинемии, гемоглобинопатии, агаммаглоблинемии.

2. Клинически полезное в сочетании с другими исследованиями – заболевания печени, нефротический синдром, злокачественные заболевания, коллагенозы.

3. Наблюдение и лечение заболевания, при которых происходят существенные нарушения в составе белков плазмы (необходимо использовать постоянно одну и ту же методику).

4. Скрининг. При популяционных обследованиях на выявление аномальных белков или дефицита отдельных белков плазмы.

N.B! Метод должен обеспечить разделение пяти основных фракций: альбумина, α1-, α2-, β- и γ-глобулина, а также небольшой зоны преальбумина.

Слайд Анализ электрофореграмм:

Для выявления разделенных белков применяют разнообразные методы.

• Прямое исследование методами ультрафиолетовой и инфракрасной спектроскопии (денситометрия)

• Осаждение неспецифическим агентом с последующим окрашиванием образца

• Специфические реакции фермент-субстрат, приводящие к образованию окрашенного нерастворимого продукта.

• Осаждение макромолекул при помощи специфических антител. Образующийся нерастворимый преципитат исследуется либо прямым способом либо последующим окрашиванием красителем (иммуноэлектрофорез).

Слайд Иммуноэлектрофорез

Это двухэтапная процедура, при помощи которой макромолекулы (обычно белки) вначале разделяются с помощью электрофореза, а затем последовательно взаимодействуют с соответствующей антисывороткой, присутствующей в среде-носителе.

Классический вариант – на 1 этапе производят разделение белков в забуференном агаровом или агарозном геле, а затем латерально, параллельно разделенным компонентам прорезают щели, которые заполняют антисывороткой. Выдерживают в течение некоторого времени для диффузии компонентов (обычно ночь). Взаимодействие антиген-антитело обнаруживается по дугам преципитации. Метод позволяет выявить антигенный состав сложной смеси белков и идентифицировать отдельные компоненты смеси с помощью моноспецифических антисывороток. В клинике используется для типирования парапротеинов сыворотки и выявления белков Бенс-Джонса.

Слайд Схема иммуноэлектрофореза

рисунок

Слайд

Слайд Ракетный электрофорез (электроиммунодиффузия)

Используют гель, содержащий АТ (как в иммунодиффузии). Вдоль кромки слоя геля делают ряд лунок, в которые помещают исследуемый материал. Затем проводят ЭФ → в слое геля создается электрическое поле → АГ входят в гель. Они обычно движутся быстрее чем АТ и в одном направлении. Высота «ракеты», образующейся в ходе реакции прямо пропорциональна концентрации АГ, она измеряется от верхней границы лунки до высоты пика. Метод удобен, надежен и прост. Используется для определения альфа-фетопротеина в амниотической жидкости.

Слайд Схема ракетного электрофореза

Рис

Слайд Иммуноэлектрофорез

Рис

Слайд Встречный электрофорез

Рис

Слайд Капиллярный электрофорез

Используют заполненные электролитом (буфером) кварцевые капилляры с внутренним диаметром 25-200 мкм и длиной 10-100 см. К концам капилляров подается высокое напряжение – 10 000 – 30 000 в. Под действием напряжения возле стенок капилляра возникает отрицательное поле, в середине – положительное (за счет того, что кварц обладает положительно заряженными группами и под действием напряжения там происходит поляризация электролита). Под влиянием электростатического поля в капилляре создается электроосмотический поток, направленный к катоду. С ним к катоду перемещаются компоненты смеси различных веществ с различной скоростью → разделение → детекция (фотометр, флуориметр, рефрактометр и т.д._ Преимущества: очень высокая эффективность разделения (белков, пептидов, витаминов, лекарственных препаратов), не требует прецизионных устройств.