5. Эмиссионная фотометрия: спектрофлуориметрия, пламенная фотометрия – 12 минут

Эмиссионная фотометрия. Это метод анализа, основанный на измерении энергии, излучаемой веществом в результате энергетически возбужденного состояния.

Основные методы эмиссионной фотометрии – а) флуориметрия, б) пламенная фотометрия.

Флуориметрия – основана на эффекте флуоресценции, который возникает в результате энергитического возбуждения исследуемого вещества под влиянием жесткого коротковолнового облучения (обычно ультрафиолетовые лучи). Выполняется на аппаратах - флуориметрах. По чувствительности намного выше колориметрических методов. Недостаток – связан именно с высокой чувствительностью, т.к. требуются громоздкие способы предварительной очистки вещества от примесей, которые вносят фоновые искажения. В клинических лабораториях используются нешироко. Определяют катехоламины.

Пламенная фотометрия – в качестве энергетического агента, вызывающего состояние возбуждения исследуемого вещества используется пламя газовой горелки. Ионы металлов окрашивают пламя в различный цвет, в соответствии с характерными для них спектрами испускания. Для выделения излучения отдельных ионов применяют специальные светофильтры. В КДЛ применяют в основном для орпеделения концентрации ионов калия и натрия. Для возбуждения этих ионов достаточно энергия низкотемпературного пламени сгорания метана в воздухе. Недостаток метода – необходимость газового оборудования. Эти методы заменяют на ионоселективные потенциометрические.

6. Основные условия измерения при работе с фотометрической аппаратурой. Источники ошибок и подходы и их предупреждению – 15 минут

1. Толщина рабочего слоя фотометрической кюветы. Оптическая плотность вещества в растворе находится в прямо пропорциональной зависимости от этой величины, т.е. чем толще рабочий слой кюветы, тем выше будет оптическая плотность измеряемых в ней растворов вещества. В ФЭК (измерение в видимой части спектра) применяют оптические кюветы из обычного стекла, с толщиной 5, 10, редко 3 мм. Для измерений в ультрафиолетовой области спектра (СФ, флуориметр) используется материал, не поглощающий УФ лучи – увиолевое, реже кварцевое стекло, толщиной 10 мм.

2. Длина световой волны. Указывается в методиках, определяется физико-химическими свойствами исследуемых растворов. Визуально они могут быть: а) прозрачные неокрашенные; б) мутные неокрашенные; в) прозрачные окрашенные. Вариант мутные окрашенные не рассматриваем, т.к. такие растворы в строгом смысле исследованию не подлежат.

2а) используются в иммунологии при определении ЦИК, в биохимии для определения НАД. Замер в УФ области при соответственно 280 и 340 нм.

2б) относится к нефелометрии, длина волны 540 нм (зеленый светофильтр) или 640 нм (красный светофильтр).

2в) длина световой волны обусловлена принципом дополнительности цветов исследуемого раствора и светофильтра. Например, для растворов, окрашенных в желтый цвет используется синий светофильтр (440 нм), для растворов синего цвета желтый (590) иногда красный – 640 нм.

Справка: видимая область спектра – 400-700 нм.

более 700 нм – инфракрасная (используется очень редко)

менее 400 – УФ длинноволновая (300-400)

УФ коротковолновая (220-300)

Способ расчета результатов. Используется 4.

а) условные единицы (у.е.).

Это фактически непосредственное выражение единиц оптической плотности исследуемого раствора. Для удобства единицы оптической плотности умножают на коэффициент 100 или 1000 для выражения у.е. в больших целых числах. Например, сиаловые кислоты 130-200 у.е. соответствует коэффициенту экстинции 0,13-0,20, умноженному на коэффициент 1000.

б) расчеты результатов исследований по стандартным (эталонным) растворам. Эталонные растворы обрабатываются параллельно с серией исследуемого биоматериала и находятся в тех же условиях, что исследуемый материал. Недостаток – повышенный расход реактивов и рабочего времени. Рациональность применения стандартных растворов определяется рамками реальной необходимости. Подготовка эталонового раствора: из реактива хч, взвешивание на аналитических весах с высокой точностью (для флуориметрии, а для ФЭК можно на торсионных), растворение в мерной колбе, концентрация вещества в стандарте должна быть близка к норме. Расчет исследований по стандартным растворам производится по способу простой арифметической пропорции: стандарт умножить на пробу разделить на стандарт.

в) расчет результатов по калибровочному графику. Недостаток - ограниченное количество методик со стабильными условиями проведения и с хорошим подчинением результатов основному закону фотометрии. Калибровочные графики строятся для каждого фотометра отдельно, перенос на другой аппарат недопустим даже в случае использования однотипных фотометров., т.к. у каждого аппарата свои технические особенности. Калибровочные графики проверяются не реже 1 раза в год.

Для построения калибровочного графика проводят исследование серии стандартных растворов, различающихся между собой концентрацией. Диапазон концентраций должен охватывать как значение физиологической нормы, так и наиболее вероятные пределы патологии для данного исследуемого компонента. Для приготовления стандартных растворов навеска берется только на аналитических весах, обязательно в параллелях (для снижения вероятности ошибок, связанных с погрешностями взвешивания), растворяются в мерной колбе.

Калибровочный график должен содержать:

• название метода исследования,

• заводской номер фотометра, к которому построен график,

• указать длину световой волны, толщину слоя кюветы,

• исходные данные для построения,

• дата построения.

4. Расчет результатов исследований с помощью коэффициента пересчета. Является наиболее простым и быстрым. Формула: С = F х Е, где С – концентрация исследуемого компонента, F – коэффициент пересчета, Е – экстинция. Недостаток как в п. 3. Коэффициент пересчета является величиной специфической для каждого отдельного теста. Обычно указывается в описании метода исследования. Можно рассчитывать самому на основании исследования стандартных растворов, обязательно с выполнением методических требований аналогичных для биоматериала. За основу можно взять ранее построенный калибровочный график. Коэффициент требует проверки не реже 1 раза в год.

Коэффициенты используются в анализаторах. Они вводятся в память компьютера и выдаются автоматически.

7. Правила эксплуатации фотометрической аппаратуры – 8 минут

Основные группы фотометрических приборов: фотометры и спектрофотометры.

Большинство фотометрических приборов устроено так, что они непосредственно указывают величину оптической плотности. Как правило имеется возможность отсчитывать результаты и по другой шкале – в процентах поглощенного или прошедшего света относительно фоновых величин. Например, на фотоэлектроколориметре (ФЭК) шкала оптических плотностей нанесена красной краской, а шкала процентов пропускания – черной. Если оптическая плотность 1, это значит, что через раствор прошло только 10% света. А остальные 90% поглотились в нем. Для большинства приборов высокого класса это предельная величина, выше которой уже трудно получить надежные результаты. Во всех, предназначенных для измерении оптической плотности приборах наибольшая точность достигается при значениях экстинции около 0,3, т.е. когда проходит примерно половина падающего света. По мере удаления в ту или другую сторону точность измерения, а, следовательно, и достоверность результатов уменьшаются.

Экстинция раствора есть произведение его концентрации на толщину слоя раствора. Оптимальными в смысле чувствительности, точности и удобства работы оказываются объемы 0,5-1 мл при длине оптического пути кюветы 1 см. Эти параметры реализованы в большинстве фотометров.

Точность фотометрии значительно возрастает, если нет необходимости каждый раз вынимать кювету для заполнения новой порцией раствора. Для этого существуют различные конструкции проточных кювет. Необходимо однако помнить, что количество раствора должно быть достаточным, чтобы промыть кювету.

Последовательность операций при работе на спектрофотометрах (фотометрах).

1. После включения в сеть прибор эксплуатируется с выдержкой 15-20 минут.

2. В зависимости от длины волны, необходимо для работы в спектрофотометрах включается лампа накаливания или УФ лампа.

3. Устанавливают длину волны, выбирая светофильтр на фотометре или вращая соответствующую рукоятку на спектрофотометре. При этом надо помнить, что для точного установления длины волны надо идти от меньших длин к большим, так как при движении в обратном направлении ошибка возрастает.

4. Устанавливаю нуль. Для этого в кюветодержателе устанавливают кювету, заполненную растворителем или контрольным раствором, и изменяя ширину щели добиваются того, чтобы показания прибора соответствовали нулю

5. Холостую пробу заменяют опытной и производят отсчет величины оптической плотности.

Возможности ошибок.

1. Работа с растворами, имеющими слишком высокую (более1) или слишком низкую (*менее 0,3) оптическую плотность резко увеличивает погрешность измерения

2. Для фотометрии пригодны лишь прозрачные растворы. Мутные растворы рассеивают свет и снижают достоверность измерений. Мутные окрашенные растворы использоваться не должны.

Заключение. Ответы на вопросы- 5 минут

Зав. кафедрой клинической лабораторной диагностики

д.м.н. И.А.Новикова ____________________ /подпись/