Лабораторная диагностика спида

В настоящее время при диагностике ВИЧ-инфекции используется:

1) Определение наличия вируса или его антигенов в материале от больного (виру-сологическими методами или ИФА);

2) Серологическая диагностика. Выявление специфических антител к поверхностным (gp.120;gp.41) и внутренним (p.24;p.17) антигенам ВИЧ;

3) Выявление патогномоничных (специфических) для ВИЧ-инфекции изменений в иммунной системе;

4) Определение возбудителей заболеваний, сопутствующих ВИЧ инфекций и инвазий.

I. Вирусологическая диагностика. Получение материала. Материалом для выделения ВИЧ служат Т-лимфоциты крови, лейкоциты костного мозга, л/у, ткани мозга, слюна, сперма, спинномозговая жидкость. Полученным материалом заражают перевиваемую культуру Т-лимфоцитов (H9). Индикацию ВИЧ в культуре клеток проводят по ЦПД (образо-вание симпластов), а также методами иммунофлуоресценции, электронной микроскопии, по выраженной активности обратной транскриптазы. Современные методы исследования позволяют обнаружить один инфицированный лимфоцит на 1000 клеток.

Точными и достоверными являются методы гибридизации нуклеиновых кислот. Они основаны на способности одноцепочечных комплементарных нитей нуклеиновых кислот, меченных радиоизотопом или ферментом (зондов), образовывать с вирусспецифическими нуклеиновыми кислотами из исследуемого материала двунитчатые структуры. Эти методы дают возможность идентифицировать 1 вирусную частицу в 10 мл крови, содержащей ВИЧ. Выявление вирусных антигенов в инфицированных Т-лимфоцитах осуществляют с помощью моноклональных антител. Однако эти методы пока что доступны только крупным лабораториям.

II. В настоящее время наибольшее распространение получили методы, основанные на выявлении противовирусных антител - серологическая диагностика.

Для проведения серологического исследования на СПИД берут 5 мл гепаринизированной крови, которую до доставки в лабораторию можно хранить 6 - 8 ч в охлажденном, но не в замороженном состоянии.

С целью серологической диагностики СПИДа используют прежде всего методы иммуноферментного анализа со стандартными иммуноферментными системами (ИФА). Это скрининговый метод. Принцип их работы основан на классическом принципе прямого ИФА. Иммуносорбентом являются полистироловые планшеты с иммобилизированным инактивированным вирусспецифическим антигеном, полученным из ВИЧ, либо синтетически. Затем следует внесение испытуемой сыворотки в разведении и инкубация в лунках с антигеном. После связывания АГ с АТ следует трехкратное отмывание несвязавшихся белков, а после этого в лунки вносят коньюгат антител к иммуноглобулинам человека с ферментной меткой. Образование специфического комплекса аГ+ АТ выявляют внесением субстрата для фермента (раствор ортофенилендиамина и перекиси водорода). В результате окраска среды меняется пропорционально количеству антител. Учет результатов проводят на спектрофотометре «Мультискан». Сыворотки крови, имеющие вирусспецифические антитела по данным ИФА, в дальнейшем необходимо исследовать методом иммунного блотинга.

Иммуноблотинг является подтверждающим тестом. Он основан на предварительном фракционировании по молекулярной массе (разделении) белков ВИЧ электрофорезом в полиакриламидном геле с последующим перенесением антигена на мембрану из нитроцеллюлозы. Т.е. белки вируса фиксированы на нитроцеллюлозной мембране на определенном расстоянии друг от друга. Затем на нитроцеллюлозную мембрану наносится испытуемая сыворотка. При этом специфические антитела образуют комплекс АГ+ АТ с конкретным АГ (gp.120, gp.41, p.24, p.18). Заключительный этап исследования состоит в выявлении антител к различным белкам ВИЧ. Для этого в систему добавляют антитела против белков человека, меченные ферментом или радиоизотопной меткой. Таким образом, в сыворотке пациента выявляют (либо не выявляют) вирусспецифические антитела к определенным антигенам ВИЧ.

III. Исследования иммунного статуса направлены на выявление:

1) уменьшения CD4/CD8 (в N 2 и >, при СПИДе - 0,5 и <);

2) снижения CD4 клеток (<200 клеток/мл.);

3) наличия одного из лабораторных признаков, включающих анемию, лейкопению, тромбоцитопению, лимфопению;

4) повышения концентрации Ig A и Ig G в сыворотке крови;

5) снижения реакции бласттрансформации лимфоцитов на митогены;

6) отсутствия кожной реакции ГЗТ на несколько антигенов;

7) повышения уровня циркулирующих иммунных комплексов.

ПАТОГЕННЫЕ ГРИБЫ. КЛАССИФИКАЦИЯ ГРИБОВ.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ МИКОЗОВ.

КЛАССИФИКАЦИЯ ГРИБОВ 

1. Ботаническая  - за основу берется строение органов полового воспроизводства и внешний вид гриба.

Номенклатура бинарная. По ботанической классификации - 6 классов:

1. Оомицеты - непатогенные, низшие грибы.

2. Хитридиомицеты - непатогенные, с несептированным мицелием.

3. Зигомицеты - несептированные грибы, которые способны вызывать заболевания человека и животных.

4. Аскомицеты (аско - сумка) - септированные грибы, патогенные для человека и животных.

5. Базидомицеты - шляпочные грибы. Могут быть причиной пищевых отравлений. Патогенный для человека род - Criptococcus.

6. Дейтеромицеты - несовершенные грибы, у которых не выявлен половой путь размножения. Их примерно 30% всех грибов.

2. Клиническая классификация (возбудители 2  0родов)

1. Кератомикозы (Trichophyton, Trichosporon).

2. Дерматомикозы (Trichophyton, Microsporum, Epidermophyton).

3. Кандидозы (Candida).

4. Глубокие микозы (Histoplasma, Coccidioides, Blastomyces, Criptococcus, Sporot-richum, Mucor, Penicillium, Aspergillus).

5. Псевдомикозы (это бактерии, но клинические проявления заболеваний, как при микозах).

Методы диагностики микозов

Забор материала  со свежих развившихся поражений, где больше элементов гриба. Пораженные волосы берутся эпиляционным пинцетом. Элементы гладкой кожи, чешуйки - скальпелем. При поражении ногтей - соскоб скальпелем или отрезается кусочек маникюрными ножницами. Соскобы со слизистой оболочки берутся шпателем. Все остальные материалы - как обычно (при бактериологическом исследовании).

Микроскопическое исследование

Исследуют: - неокрашенные (нативные) окрашенные препараты. Предварительно материал просветляется. Для этого материал обрабатывают щелочью (10-30%) в течение 20 минут. Можно также производить просветление материала разведением в физрастворе. Чтобы сконцентрировать материал, его центрифугируют.

Нативные препараты. Каплю материала наносят на предметное стекло, затем добавляют раствор Люголя и спиртовой раствор глицерина (по 50% каждого). Накрывают покровным стеклом и исследуют в фазовоконтрастном или световом микроскопе.

Окрашенные препараты готовят обычным способом, окрашивают по Граму, ЦильНильсену, Романовскому-Гимзе и специальными методами. Фиксация - только жидким фиксатором.

Микологическое исследование  включает все этапы культурального метода: выделение чистой культуры и идентификацию. Для удаления бактериальной флоры материал предварительно обрабатывают антибиотиками широкого спектра действия. Засевают на специальные среды с кислой рН и культивируют при пониженной температуре (26 - 30⁰ С). Колонии вырастают через несколько дней. Их изучают под малым и большим увеличением микроскопа. Идентификация - на основании морфологических признаков.

Большинство питательных сред для грибов готовится на основе среды Сабуро (водо-проводная вода + агар-агар + пептон + мальтоза).

Экспериментальный метод применяется для оценки патогенности выделенного гриба-возбудителя. При заражении используют чистые культуры или патологический материал. Подбор животных, техника введения материала, этапы работы - такие же, как в бактериологии.

Иммунологические исследования . (серологический и аллергический методы) - такие же, как в бактериологии.

Гистологическое исследование. - такое же, как в бактериологии (мазки-отпечатки, срезы), но изучают не только морфологию гриба, но и реакцию ткани на возбудителя, глубину поражения.

Лабораторная диагностика поверхностных микозов (кератомикозов, дерматомикозов)

1. Микроскопия патологического материала.

2. Выделение чистой культуры гриба и идентификация по морфологии.

Лабораторная диагностика кандидомикоза.

1. Микроскопия патологического материала.

2. Выделение чистой культуры: производится количественный посев материала несколько раз с промежутками в 5-7 дней. Если кандиды обнаруживаются многократно в количестве 10 53 0 на г. исследуемого материала и более, то диагноз кандидомикоза подтверждается.

3. Серологический метод: используется РСК и РА (диагностический титр антител 1:160) и РПГА (1:1600). Ставят также РП с белковыми и полисахаридными антигенами кандид.

4. Аллергический метод (кожные пробы по типу реакции Манту).

5. Выделенная культура проверяется на вирулентность на белых мышах. Если доза до 1 млн. клеток кандид вызывает гибель мыши, культура считается вирулентной.

Лабораторная диагностика глубоких микозов.

А. Криптококкоз:

1. Микроскопия патологического материала.

2. Выделение чистой культуры.

3. Серологическая диагностика (РА, РП, РСК, РПГА). Эти реакции редко бывают положительными.

4. Выявление криптококкового антигена в крови и ликворе больных с помощью РП.

5. Заражение белых мышей.

Б. Кокцидиоидоз:

1. Микроскопия патологического материала.

2. Выделение чистой культуры.

3. Серологическая диагностика:

с 2 недель до 4 месяцев выявляют антитела в РП,

с 4 месяцев и позже ставят РСК (диагностические титры 1:4 - 1:32).

4. Кожные пробы с кокцидиоидином (в разведении 1:100 и 1:1000). Проба положительная, если через 24-48 часов эритема больше 0,5 см.

В. Гистоплазмоз:

1. Микроскопия патологического материала.

2. Выделение чистой культуры.

3. Серологическая диагностика: первые три месяца в РСК и РП выявляются анти-h-антитела (это острый процесс). Позже 3 месяцев в РСК и РА выявляют анти-m-антитела (хронический процесс).

4. Кожная проба с гистоплазмином.