Novicka_praktykum_z_biotehnologii_ch1

Лабораторна робота №4

ВИМОГИ ДО ОСНОВНИХ ВИДІВ СУБСТРАТІВ.

Мета: Ознайомитися з основними видами субстратів та методами приготування середовищ для культивування матричних розплодок мікроорганізмів-продуцентів у біотехнологічних процесах.

Культивування є важливою стадією збереження, підтримування, напрацювання біомаси та синтезу цінних метаболітів штамами – продуцентамі. Будь-який біотехнологічний об‘єкт потребує поживного середовища, до складу якого входить субстрат, який є джерелом вуглецю та енергії, забезпечує нормальний розвиток та біосинтетичну активність об’єкта.

Для задоволення потреб мікроорганізмів у поживних компонентах необхідні середовища різного хімічного складу. Будь-яке поживне середовище повинно відповідати наступним вимогам:

містити усі необхідні для росту та розмноження мікроорганізму речовини;

мати достатню вологість;

відповідне рН, Еh;

усі середовища повинні бути максимально уніфікованими.

За складом середовища поділяють на:

культуральне середовище з хімічно визначеним складом – так зване синтетичне поживне середовище, що складається з хімічно визначених інгредієнтів (з відомою молекулярною структурою та ступенем чистоти);

культуральне середовище з неповністю охарактеризованим хімічним складом – середовище, що складається повністю або частково з природних матеріалів, оброблених або незмінних, хімічний склад яких визначений неповністю (з природних продуктів тваринного та рослинного походження, з різних екстрактів, бульйонів та відварів з додаванням неорганічних солей, вуглеводів та азотистих речовин).

Мікроорганізми, що нездатні синтезувати усі органічні сполуки, необхідні для їх росту та розмноження (вітаміни, амінокислоти,

21

нуклеотиди) називаються ауксотрофними та потребують внесення у середовище факторів росту. Ауксотрофні штами використовують у генетичних дослідженнях як маркерні.

За консистенцією середовища бувають:

рідкі – для вивчення фізіолого-біохімічних властивостей штамів-мікроорганізмів, для накопичення біомаси та продуктів біосинтезу;

напіврідкі – для тривалого збереження штамів-мікроорганізмів;

щільні – для виділення чистих культур, вивчення морфології колоній, кількісного обліку, визначення антагоністичних властивостей, селекційного відбору;

сипучі середовища – використовують для зберігання посівного матеріалу культур продуцентів. До них відносять розварене пшоно, активоване вугілля, кварцовий пісок, просочений поживним розчином.

За призначенням середовища поділяють на:

звичайні – для культивування більшості мікроорганізмів (як приклад, МПА, МПБ);

спеціальні – для виділення та культивування певних груп та видів штамівмікроорганізмів;

елективне – селективне середовище збагачення, що підтримує розмноження певних видів мікроорганізмів, частково або повністю пригнічуючи ріст інших мікроорганізмів (для виділення певного виду з місць його природного накопичення). (наприклад, середовище Раппапорта-

Василиадиса (Rappaport-Vassiliadis).

диференційно-діагностичні – для вивчення біохімічних властивостей та для диференціації штамів за ферментативною

активністю.

Також за призначенням середовища розрізняють:

Середовища для транспортування – культуральне середовище, призначене для збереження та підтримування життєздатності мікроорганізмів з моменту їх відбору до початку аналізу у лабораторії. Такі середовища, як правило містять такі речовини, що не допускають розмноження

22

мікроорганізмів, але гарантують їх збереження (наприклад, транспортне середовище Стюарта або Еймса).

Середовища для збереження мікроорганізмів – культуральне середовище, призначене для збереження та підтримування життєздатності мікроорганізмів протягом тривалого періоду, щоб захистити їх від несприятливих факторів та дозволити відновити ріст мікроорганізму після цього періоду (наприклад, яєчне середовище Дорсе);

Середовище для відновлення – культуральне середовище, що дозволяє мікроорганізмам, які знаходяться у стані стресу або ослаблення, відновлювати здатність до нормального росту без обов‘язкових умов до їх розмноження.

Середовище збагачення – культуральне середовище, що забезпечує особливо сприйнятливі умови для розмноження мікроорганізмів.

Культуральні середовища, що мають багатоцільове використання – культуральні середовища, що можуть відноситися до деяких категорій одночасно, наприклад кров‘яний агар є середовищем відновлення, виділення та диференційним, для визначення гемолізу.

ОСНОВИ ПОЖИВНИХ СЕРЕДОВИЩ. До складу поживних середовищ входять різні компоненти: пептон (джерело азоту), вуглеводи (джерело вуглецю), мінеральні речовини (неорганічні солі), селективні речовини, вітаміни, фарбники та індикатори рН, гелеутворюючі компоненти.

1. Пептони (м’ясний, казеїновий, соєвий, желатиновий,

дріжджовий та ін.) - продукти гідролізу білка, що являють собою суміш поліпептидів, олігопептидів, амінокислот, органічних джерел азоту, солей та мікроелементів. Характеристика пептону залежить від джерела білка та типу гідролізу (кислотного чи ферментативного). Гідролізати з високим ступенем розщеплення білка використовують для вирощування найбільш вимогливих до поживних середовищ мікроорганізмів. Гідролізати з низьким ступенем розщеплення використовують для вирощування більшості патогенних бактерій та для культивування вакцинних штамів.

23

Гідролізати крові краще використовувати для культивування гемофільних мікроорганізмів, а гідролізати молока – для молочнокислих бактерій.

Гідролізати казеїну, отриманого шляхом панкреатичного та кислотного гідролізу, використовують у складі середовищ для культивування штамів анаеробів та під час отримання мікробних токсинів.

Автолізати та гідролізати дріжджів отримують з дріжджів Sac. сerevisiae та Candida spp. Вони містять пептиди, амінокислоти, вітаміни, пуринові та пиримидинові основи та використовуються у складі середовищ як джерело амінного азоту та факторів росту.

Соєвий гідролізат містить багатий набір поживних речовин та використовується у складі середовищ для культивування вимогливих мікроорганізмів.

Для контролю пептонів використовують наступні тести:

Ступінь перетравлювання;

Вміст азоту;

Втрати при 100оС;

Вміст амінного азоту;

Зольність;

Відсутність нітритів;

Вміст солей (NaCl);

Вміст фосфатів;

Мікроелементи;

Вуглеводи, що ферментуються;

Ліпіди;

Вітаміни;

Сумісність з іншими інгредієнтами при 121 оС - 15 хв.;

Культуральні та біохімічні властивості тест-культур (утворення індолу, сірководню, ацетилметилкарбінолу).

2.Вуглеводи. До складу поживних середовищ здебільшого входять наступні вуглеводи: адоніт, інулін, саліцин, арабіноза, крохмаль, сахароза, галактоза, ксілоза, сорбіт, глікоген, лактоза, трегалоза, гліцерин, мальтоза, фруктоза, глюкоза, манніт, целлобіоза, декстрин, манноза, еритрит, дульцит, рамноза, ескулін, інозит, раффіноза.

Деякі мікроорганізми можуть утилізувати широкий спектр вуглеводів,

інші більш примхливі або утилізують лише один вуглевод. Останні

24

можна ідентифікувати за ферментацією або окисленням ними вуглеводів, доданих у середовище.

Вуглеводи, що використовуються у поживних середовищах, перевіряють на відсутність домішок. Контроль істинності вуглеводу перевіряють, готуючи рідкі та щільні поживні середовища з відомим вуглеводом – стандартним та тим, що досліджується. Перевіряють здатність вуглеводів підтримувати ріст мікроорганізмів. На щільних середовищах після культивування порівнюють характеристики колоній на стандартному середовищі та тому, що досліджується.

3.Мінеральні речовини. Мінеральні солі необхідні для

росту та метаболізму усіх живих клітин. Для більшості бактерій необхідно наявність у поживному середовищі Na, K, Mg, Fe2+, 3+.

4.Селективні речовини (солі жовчних кислот та бичача

жовч). Речовини, що отримують з жовчі, вводять до складу поживних середовищ для диференціації бактерій, адаптованих та неадаптованих до умов кишечнику. Для диференціації бактерій за толерантністю до жовчі готують селективні середовища з підвищеною концентрацією жовчі та її похідних. У середовищі ці речовини не повинні впливати на первинний колір індикатора та його подальші зміни у процесі росту мікроорганізмів. Щільні поживні середовища з різними солями жовчі перевіряються методом поверхневої краплі за Miles та Misra.

5.Фарбники та індикатори. Фарбники, що додаються у

середовища використовують як селективні речовини, а також як індикатори рН та окисно-відновного потенціалу. Їх інгібуючи активність залежить від взаємодії з іншими компонентами середовища. Так, активність бріліантового зеленого по відношенню до E. coli суттєво варіює у розчинах різних пептонів. З бріліантовим зеленим взаємодіють солі жовчі, в результаті чого знижується токсичність фарби, що необхідно враховувати під час конструювання середовищ. Анілінові фарбники більш токсичні у стані повного окислення, а під час їх стерилізації у присутності пептону можливе їх часткове відновлення. Також під час використання агару з високим вмістом мінеральних речовин часто спостерігається несумісність компонентів середовища. Окрім контролю хімічної чистоти

25

фарбник повинен бути перевірений мікробіологічним методом, шляхом висіву референт-штаму у середовище зі стандартним та досліджуваним фарбником.

Індикатори вводять у поживні середовища для визначення змін рН середовищ під час росту мікроорганізмів та контролі Еh. Наприклад, феноловий червоний у діапазоні рН 6,8-8,4 змінює колір середовища від жовтого до червоного, бромтимоловий синій у діапазоні рН 6,0-7,6 з жовтого на синій, а фенолфталеїн у діапазоні рН 8,3-10,0 з безкольорового на червоний.

6. Гелеутворювачі. Для конструювання щільних середовищ у якості ущільнювача використовують агар, продукт екстракції червоних та бурих водоростей. Основний компонент агару – кальцієва сіль ефіру сірчаної кислоти та поліцукру агарози. Більшість мікроорганізмів не розщеплює агар – він є інертним компонентом поживного середовища.

Для використання у складі середовищ агар-агар повинен відповідати певним вимогам:

26

У щільних середовищах його концентрація складає 1-2%, у напіврідких 0,3-0,4%. В ідеалі, розплавлений агар повинен бути кристально чистим, без ознак каламуті або осаду. Причиною каламуті є несумісність мінеральних речовин. Важливою характеристикою агару є параметри дифузії різних хімічних сполук у гелі. Ця властивість агаризованих середовищ використовується для оцінки активності вітамінів та антибіотиків.

Агар перевіряють на можливу токсичність. Для цього на досліджуване поживне середовище та на середовище зі стандартним агарагаром засівають швидко ростучі мікроорганізми, з наступним порівнянням швидкості росту, розміром, форми, кольору колоній.

КОНСТРУЮВАННЯ ПОЖИВНИХ СЕРЕДОВИЩ. Для культивування мікроорганізмів на даний час використовують «нестандартні поживні середовища», які необхідно контролювати за вмістом загального та амінного азоту та рН.

Для конструювання поживних середовищ необхідно дотримуватися наступних принципів:

задоволення поживних потреб мікроорганізмів;

вибір джерел сировини для конструювання середовищ;

диференціація поживних середовищ за цільовим призначенням;

оптимізація поживних середовищ;

стандартизація поживних середовищ.

Якість поживного середовища контролюють за такими параметрами:

колір;

запах;

вологість;

розчинність;

прозорість;

гелеутворення;

температура плавлення;

рН;

еH;

ростові якості середовища визначають для відповідних типових культур тестмікроорганізмів за показниками:

швидкість росту;

27

чутливість;

кількість біомаси;

які мікроорганізми ростуть на середовищі;

мікроорганізми, ріст яких пригнічується;

характеристика колоній на середовищі;

стабільність збереження основних властивостей мікроорганізмів.

Швидкість росту визначається кривою росту та дозволяє оцінити стандартність середовищ та їх компонентів й характеризує середовища як:

середовище з коротким лаг-періодом для швидкого росту невеликої висхідної кількості клітин (для визначення стерильності, для отримання посівного матеріалу для ферментації і ін.);

середовище, що забезпечує максимальну кількість клітин, може бути використана для отримання біомаси під час виготовлення вакцин. Чутливість визначається за мінімальним числом

колонієутворюючих одиниц (КУО) під час посіву мікробної завісі заданої концентрації, при якому спостерігається ріст на усіх засіяних чашках.

Стабільність збереження основних властивостей мікроорганізмів оцінюють шляхом вивчення характерних для певного виду морфологічних та фізіологічних ознак під час росту на середовищі, яке контролюється.

ЗАВДАННЯ.

1.Вивчити якість готового поживного середовища за усіма можливими параметрами.

Лабораторна робота №5

МЕТОДИ ПРИГОТУВАННЯ СЕРЕДОВИЩ ДЛЯ КУЛЬТИВУВАННЯ ШТАМІВ МІКРООРГАНІЗМІВ У БІОТЕХНОЛОГІЧНИХ ПРОЦЕСАХ.

Мета: навчитися готувати середовища для культивування матричних розплодок мікроорганізмів-продуцентів у біотехнологічних процесах.

28

ПРАВИЛА РОБОТИ З СУХИМИ ПОЖИВНИМИ СЕРЕДОВИЩАМИ

До роботи допускається персонал, якій ознайомлений з технікою безпеки під час роботи з сухими середовищами.

Більшість поживних середовищ у сухому вигляді являють собою дрібнодисперсні литки порошки, тому слід уникати їх вдихання, особливо глибокого. Потрапляння таких порошків може викликати подразнення верхніх дихальних шляхів або, навіть, пневмонію. Тому, слід уникати надмірного розпорошення порошку, або працювати у масках та респіраторах. При потраплянні порошку у ротову порожнину, останню промити, після чого випити 2 склянки води. У разі вдихання - звернутися за медичною допомогою.

Деякі поживні середовища мають у своєму складі токсичні речовини (натрія азид, циклогексимід, літія хлорид, фуксин основний, натрія гідроселенит та ін..), тому слід уникати тривалого контакту порошку середовищ зі шкірою, або працювати у рукавичках. З токсичними речовинами необхідно працювати чітко дотримуючись інструкції.

Не використовувати середовище після закінчення терміну збереження

Герметично закривати упаковки з залишком середовища.

ВИМОГИ ДО ЗБЕРЕЖЕННЯ СУХИХ ПОЖИВНИХ СЕРЕДОВИЩ. Сухі поживні середовища випускають у вигляді порошків, гранул та таблеток, вони гігроскопічні, чутливі до дії вологи, температури, світла та перепадів температури. Тому, зберігати середовища необхідно в умовах, що рекомендує виробник та не використовувати після закінчення строку їх збереження. Сонячне світло негативно впливає на середовища, тому останні зберігають у темноті (шафи). У зв‘язку з високою гігроскопічністю сухі поживні середовища псуються від надлишку вологи, тому тара у якій вони зберігається повинна бути герметичною. Сухі поживні середовища, як правило, мають термін збереження в оптимальних умовах не більше 2-5

29

років. Невідкриті флакони з середовищами слід зберігати при температурі нижче 25 оС.

ПРАВИЛА ПРИГОТУВАННЯ ПОЖИВНИХ СЕРЕДОВИЩ

1.Дотримуватися належної лабораторної практики та інструкцій виробників під час роботи з сухими поживними середовищами.

2.Перед приготуванням середовища перевірити повну ідентичність усіх компонентів (код та номір партії).

3.Вода. Для розчинення середовища використовувати дистильовану або деіонізовану воду з рН не нижче 5,5. Якщо рН нижче рекомендується воду прогріти для видалення залишків СО2. Дистильовану воду слід зберігати у контейнерах, виготовлених з інертних матеріалів (скло, поліетилен), що не інгибують ріст мікроорганізмів. УВАГА! Вода, що пройшла через іонообмінні пристрої (деіонізована), може бути обсіменена мікроорганізмами.

4.Зважування. Зважують дотримуючись інструкції до лабораторних вагів та заходів безпеки під час зважування.

5.Розчинення та дисперсія. Сухі середовища потребують швидкої дисперсії шляхом постійного перемішування з підігрівом. Середовищам, що містять агар, необхідно декілька хвилин для всмоктування води з перемішуванням до підігріву. Для середовищ, що готуються з окремих компонентів, останні додаються окремо, повністю розчиненими. Для розчинення сухого середовища у посуд наливають половину потрібної води, потім наважку середовища, ретельно розмішують та вносять усю воду. Порошок на стінках сосуду повинен бути змитий. Забезпечити ретельне перемішування середовища можна скляною паличкою або колбою, об‘ємом у двічі більшим за кількість середовища.

6.Вимірювання рН. Для визначення рН середовища використовують рН-метр (індикаторні смуги не використовують). Після стерилізації та охолодження середовища, або окремих його компонентів, до температури 25 °С, рН-метрію проводять згідно інструкції. Як правило, рН середовища після стерилізації зміщується, тому необхідне значення останнього отримують додаючи, по краплях, NaOH, концентрацією приблизно 40 г/л (1 мол/л) або соляною кислотою (HCl) приблизно 36,5 г/л (1 мол/л) .

30