kld_50_54_55

Буферные растворы — растворы, сохраняющие неизменными значения рН при разбавлении или добавлении небольшого количества сильной кислоты или основания. Протолитические буферные растворы представляют смеси электролитов, содержащие одноимённые ионы.

Способность растворов поддерживать постоянное значение pH небезгранична. Буферные смеси можно различить по силе оказываемого ими сопротивления по отношению к действию кислот и оснований, вводимых в буферный раствор.Количество кислоты или щелочи, которое нужно добавить к 1 л буферного раствора, чтобы значение его pH изменилось на единицу, называют буферной емкостью. Таким образом, буферная емкость является количественной мерой буферного действия раствора. Буферная емкость зависит от состава буферного раствора, концентрации и соотношения компонентов.

В =

В – буферная ёмкость,

n_Э–количество моль-эквивалента сильной кислоты или щелочи,

рН_Н –начальное значение рН ( до добавления кислоты или щелочи)

рН_К–конечное значение рН (после добавления кислоты или щелочи)

ΔрН – изменение рН.

На практике буферная ёмкость рассчитывается по формуле:

В =

V – объём кислоты или щелочи,

N – эквивалентная концентрация кислоты или щелочи,

V_буф.-объём буферного раствора,

Δ рН –изменение рН.

Область буферирования - интервал pH, в котором буферная система способна поддерживать постоянное значение pH. Обычно он равен pK_a±1.

Буферы, применяемые для биологических исследований, должны удовлетворять ряду требований:

1. Обладать достаточной буферной емкостью в требуемом диапазоне значений рН.

2. Обладать высокой степенью чистоты.

3. Хорошо растворяться в воде и не проникать через биологические мембраны.

4. Обладать устойчивостью к действию ферментов и гидролизу.

5. рН буферных растворов должен как можно меньше зависеть от их концентрации, температуры и ионного или солевого состава среды.

6. Не оказывать токсического или ингибирующего действия.

7. Комплексы буфера с катионами должны быть растворимыми.

8. Не поглощать свет в видимой или ультрафиолетовой областях спектра.

К сожалению, этим требованиям удовлетворяют далеко не все буферные растворы. Так, фосфаты обладают способностью осаждать поливалентные катионы и во многих системах выступают в качестве метаболитов или ингибиторов; трис-буфер иногда оказывает токсическое или ингибирующее действие.

Растворы белков обладают буферными свойствами за счет их амфотерности. Проявляются в связывании не только протонов, но и других заряженных частиц. Основная масса поступающих в кровоток веществ (красители, жирные кислоты, липиды, водорастворимые наркотики, релаксанты) связывается с белками, проявляя конкурентные отношения. Естественно, при этом уменьшается буферная емкость белков в отношении протонов, и высокая концентрация последних затрудняет освобождение и ослабляет действие веществ, образующих положительные заряды. Аминокислоты благодаря аминогруппе могут реагировать не только как слабые кислоты, но и как основания, то есть сами проявлять буферные свойства, присоединяя или отдавая ион водорода.

Уравнение буферной системы рассчитывается по формуле Гендерсона-Хассельбаха:

рН = рК + ℓg, pOH = pK + ℓg,

где рК = -ℓgК_Д.

С – молярная или эквивалентная концентрация электролита (C = V*N)

Центрифугирование — разделение неоднородных систем (напр., жидкость — твердые частицы) на фракции по плотности при помощи центробежных сил. Приборы, применяемые для этой цели, называют центрифугами. Основной частью центрифуги является ротор с монтированными в нем гнездами для центрифужных пробирок. Ротор вращается с большой скоростью, вследствие чего создаются значительные по величине центробежные силы, под действием которых происходит разделение механических смесей, например осаждение взвешенных в жидкости частиц.

Центрифугирование применяется для отделения осадка от раствора, для отделения загрязненных жидкостей, производится также центрифугирование эмульсий (напр., сепарирование молока). Центрифугирование бетона применяется для увеличения его прочности. В клинических и санитарно-гигиенических лабораториях центрифугирование используют для отделения эритроцитов от плазмы крови, сгустков крови от сыворотки, плотных частиц от жидкой части мочи и т. д.

Конструктивные особенности центрифуг заключаются в способе крепления к валу барабана и в пространственном его расположении. Все конструкции должны обеспечить, прежде всего, хорошую устойчивость ротора центрифуги. Поскольку вал приводит во вращение большую массу, он должен быть особенно устойчивым. Скорость вращения вала не должна равняться его критической скорости вращения, а должна быть больше или меньше ее. В первом случае вал называют гибким, во втором жёстким.

Препаративное центрифугирование Проводят с целью получения определенных компонентов из биологического материала для дальнейшего биохимического анализа. Такими компонентами могут быть клетки, их органеллы (митохондрии, рибосомы, ядра и др.) и макромолекулы (белки, ДНК и др.).

Аналитическое центрифугирование Проводят для выявления характеристик однородного материала, например, макромолекул. Материал центрифугируют, вследствие чего под контролем оптических систем происходит осаждение частиц. При этом можно определить их однородность, молекулярную массу, структуру, так как форма и масса частиц оказывают влияние на скорость осаждения. Проводя расчеты по стандартным формулам, можно вычислить эти параметры и составить характеристики исследуемого материала.

Ультрацентрифуга — прибор для разделения частиц размером менее 100 нм (коллоидов, субклеточных частиц, макромолекул белков, нуклеиновых кислот, липидов, полисахаридов, синтетических полимеров и пр.), взвешенных или растворенных в жидкости. Это достигается вращением ротора, создающего центробежное поле с ускорением, на много порядков превышающим ускорение силы тяжести.

Аналитическое ультрацентрифугирование используют для исследования гомогенности (чистоты) препаратов биополимеров (белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов), а также для определения констант седиментации, молекулярной массы, констант ассоциации и размеров макромолекул. Ультрацентрифугирование применяется в медицине при клинической диагностике, для приготовления кровезаменителей и т.п.

Классификация хроматографических методов

В основе хроматографического разделения лежат различные механизмы, как правило,дополняющие друг друга.

По доминирующему механизму могут быть выделены следующие виды хроматографии:

1) адсорбционная (в основе лежит явление адсорбции);

2) распределительная (основана на различии коэффициентов распределения вещества между двумя несмешивающимися жидкостями);

3) ионообменная (основана на различии констант ионного обмена разделяемых ионов между раствором и ионитом);

4) ситовая (основана на различии размеров молекул; используется в основном для разделения белков и других высокомолекулярных соединений на фракции);

5) хемосорбционная; в зависимости от типа химической реакции выделяют: а) осадочную; б) редокс-хроматографию;в) лигандообменную (аффинную); г) биоспецифическую.

По цели проведения различают следующие виды хроматографии:

- аналитическая хроматография используется для качественного и количественного анализа смеси веществ;

- препаративная хроматография предназначена для выделения из смеси чистых компонентов или для вещества от примесей.

По характеру подвижной и неподвижной фаз основные разновидности хроматографии: газо-жидкостная, газо-адсорбционная, жидкостно-жидкостная, жидкостно-адсорбционная, ионообменная, гель-фильтрация.

По технике эксперимента хроматография может быть колоночной (разновидность – капиллярная хроматография) и плоскостной (тонкослойной и бумажной).

Газовую хроматографию применяют для разделения летучих термически устойчивых веществ с молекулярной массой до 500. Она имеет огромное значение как для качественного, так и количественного анализа и благодаря высокой чувствительности позволяет обнаруживать микрограммовые количества соединений (до 10^{-6 г).} Колоночная хроматография широко используется для количественного разделения смесей.

Электрофорез – метод разделения веществ, основанный на явлении миграции заряженных микрочастиц в жидкой среде под действием электрического поля. Электрофорез широко используется для полуколичественного определения белков сыворотки крови и для выявления парапротеинов. Электрофорез проводится с сывороткой, а не с плазмой, так как присутствие фибриногена в плазме приводит к образованию выраженной β2-полосы, что может быть расценено как парапротеинемия

Электрофоретические методы

1. зональный (полуколичественный метод, позволяющий разделить смесь белков в зависимости от их молекулярной массы и электрического заряда). С помощью зонального электрофореза можно исследовать не только сыворотку, но и другие биологические жидкости, например спинномозговую жидкость и мочу. Этот метод позволяет оценить белковый состав исследуемой пробы и выявить моноклональные антитела.

2. изофокусирование

3. изотахофорез(метод разделения различных типов ионов по их подвижности в электрическом поле). Применение: аналитическое разделение (мкг) пептидов, белков, нуклеотидов, органических кислот, ионов металлов (частично изотопов) с высоким разрешением; препаративное разделение белков (г), накопление в виде узкой зоны следовых количеств веществ (мкг) из больших объемов пробы вследствие эффекта концентрирования, определение электрофоретической подвижности.