3 курс / Микробиология / MIKROBA_EKZAMEN_1_0

Особенность роста клеточных культур: Первичные клетки, которые делятся в культуре, могут претерпевать так называемое контактное торможение. В большинстве случаев достижение плотного монослоя сопровождаются прекращением клеточных делений. Нормальные клетки могут в течение некоторого времени полностью сохранять жизнеспособность в таком покоящемся состоянии. По мере роста клеточного монослоя происходят следующие изменения:

-клетки становятся более скученными и менее распластанными, что приводит к уменьшению доли клеточной поверхности, обращённой к среде;

-среда истощается по питательным и другим компонентам, особенно в зоне, непосредственно примыкающей к клеткам.

Ослабленным контактным торможением характеризуются раковые клетки, а также клетки, трансформированные вирусами.

54. Сущность методов индикации. Механизм ЦПД и ЦП.

для выделения чистых культур вирусов в лабораторных условиях в настоящее время используются следующие живые объекты (биологические модели): 1) культура клеток (тканей, органов); 2) куриные эмбрионы; 3) лабораторные животные.

Индикация вируса в курином эмбрионе. Индикация вируса в курином эмбрионе производится по гибели эмбриона, положительной реакции гемагглютинации на стекле с аллантоисной или амниотической жидкостью, по образованию фокусных поражений («бляшек») на хорион-аллантоисной оболочке.

Индикация вирусов в культурах клеток. Индикатором наличия вируса в зараженных культурах клеток может служить:

1)цитопатическое действие вируса (ЦПД) - дегенеративные изменения в кл, кот появ в результ репродукции в них вирусов.

Различаю: *Полная дегенерацияклетки монослоя подверг значит изменениям, большое колво их слущив со стекла. Остающиеся клетки сморщены, для них харак двойное лучепреломление –сильное свечение при микроскопии. *Частичная дегенерация КК:

-По типу гроздеобразования(кл округляются, частично сливаютя)

-По типу очаговой деструкции( на фоне сохранившегося монослоя появл очаги пораж кл(микробляшки).

-По типу симпластообразования

-Пролиферативный тип измененийкл трансформир в злокачеств, интенсивно пролиферируют.

Цитопатические эффектыоценивают при микроскопии клеточных культур. По степени поражения клеток выделяют вирусы с высокой или умеренной цитопатогенностью:

2) обнаружение внутриклеточных включений, располагающихся в цитоплазме и/или в ядрах пораженных клеток;

3) положительная реакция гемагглютинации (РГА) или гемадсорбции (РГАдс). Некоторые вирусы, в частности, вирус гриппа, обладают особыми рецепторами (гемагглютининами), с помощью которых они адсорбируются на эритроцитах и вызывают их склеивание (гемагглютинацию). Такие вирусы легко обнаруживаются с помощью реакции гемагглютинации или гемадсорбции (эритроциты адсорбируются на инфицированных вирусами клетках культуры тканей);

4) феномен бляшкообразования. Бляшки(негативные колонии вирусов) – очаги разрушенных вирусом клеток под агаровым покрытием. Их подсчит для того чтоьы количественно проанализ инфекц активн вирусов. Бляшки выявляют путем окрашивания культуры нейтральным красным –погибшие кл не окрашив(в виде светлых пятен)

Также бляшки выявл под бентонитовым покрытием. На жив кл бентонит адсорбир, на бляшкахнет.

5) цветная реакция Солка.( Цветная проба) Если клетки активно осуществляют метаболизм, рН среды сдвигается в кислую сторону, и среда окрашивается в желтый цвет. В случае размножения вируса клетки погибают, рН среды мало меняется, и она сохраняет первоначальный (малиновый) цвет или (при нейтральной рН) приобретает оранжевый;

цветную реакцию используют:

1)для выявления вируса и его титрования;

2)с целью идентификации вируса по нейтрализующему действию специфической сыворотки;

3)для обнаружения и титрования вирус нейтрализующих антител в исследуемых сыворотках.

Индикация вирусов на лабораторных животных. Индикация вируса основана на обнаружении животных признаков инфекционного заболевания, регистрации их гибели, изучении характера патоморфологических и патогистологических изменений в тканях и органах, выявлении положительной реакции гемагглютинации.

55. Сущность методов идентификации вирусов. На примере нейтрализ ЦПД обьясните как опред серовар вируса.

Определение типа вируса (его идентификация) основано на нейтрализации биологической активности вируса с помощью типоспецифических сывороток. Конечный результат ее может быть установлен на основании следующих признаков:

1) нейтрализация цитопатического действия: При изучении нейтрализации цитопатического действия вирусов в культуре клеток компонентами реакции является вирусодержащий материал (культуральная жидкость, инфицированные или дезинтегровани культуры клеток), иммунная противовирусная сыворотка, специальные питательные среды (солевой раствор Хенкса, среды Игла, 199 и тому подобное) и культура клеток в пробирках или флаконах. Из вирусодерж мат готовят серийные разведения и добав к ним специф сыворотку. Смесь инкуьируют 30-60 мин при т37град, после зараж КК.

Положительная РНотсутствие ЦПД. Зетем определяют индекс нейтрализацииотнош титра вируса в контроле к титру вир в опыте. 50 и вышедостоверное соответствие вируса антисыворотке.

2) нейтрализация реакции гемадсорбции; Принцип реакции базируется на явлении гемадсорбции. Оно заключается в том, что эритроциты приобретают способность адсорбироваться на поверхности культур клеток, которые испытали

модификацию в результате появления в оболочке гликопротеинов вирусов. Антитела иммунной сыворотки при взаимодействии с поверхностными антигенами вирусов, представленными в оболочке, связывают их, вследствии чего тормозится адсорбция эритроцитов на клетках.

3)изменение проявления цветной пробы; При нейтрализации вирусов антителами специфической сыворотки или

при отсутствии соответствующих вирусов создаются условия для развития культур клеток. Они остаются живыми, активно осуществляют обмен веществ, в результате чего образуются продукты клеточного метаболизма, которые сдвигают рН среды в кислую сторону. Это приводит к изменению цвета индикатора фенолрота из красного (щелочное рН) на соломенно-желтый или оранжевый (кислое значение рН).

4)задержка (торможение) реакции гемагглютинации: смешивают культуральную среду, содержащую возбудитель, с известной коммерческой антисывороткой и вносят в культуру клеток. После инкубации определяют способность культуры к гемагглютинации и при её отсутствии делают заключение о несоответствии вируса антисыворотке.

5) нейтрализация в опытах на животных.

Таким образом РН (реакция нейтрализации) основана на подавлении соответствующей реакции, феномена, развития инфекционного процесса после внесения в культуру или введения в организм животного смеси вируса со специфичными AT, содержащимися в диагностической сыворотке.

56. Обоснуйте меры специфический профилактики полиомиелита. Подберите препараты, объясните их состав и способ применения.

Специфическая профилактика осуществляется активной иммунизацией. Первая вакцина была предложена Дж.Солком в 40-х годах XX века. Эта вакцина состояла из инактивированных формалином полиовирусов I, II и III типа. Однако она не вызывала образования стойкого иммунитета и была очень болезненна при внутримышечном введении.

Вторая вакцина была предложена Сэбином. Она состояла из живых аттенуированных (ослабленных) штаммов-мутантов трех типов полиомиелита. Эти штаммы были лишены инфекционных свойств, но сохранили иммуногенность.

В 60-х годах М. П. Чумаков и А. А. Смородинцев, использовав ослабленный штамм, полученный Сэбином, разработали метод приготовления вакцины в виде конфет-драже, что значительно облегчило ее применение. Массовая вакцинация детей привела к почти полной ликвидации полиомиелита в СССР, за, что авторы получили Ленинскую премию.

Механизм действия вакцины состоит в интерференции вирусов, т. е. вакцинный штамм вируса, заселяя клетки кишечника, блокирует репродукцию дикого штамма, а также в образовании вируснейтрализующих антител.

Препараты, применяемые для профилактики полиомиелита

Вакцина полиомиелитная пероральная I, II, III типов (ОПВ) (вакцина Сэбина)

Состав препарата, назначение, показания к применению. Вакцина представляет собой препарат из аттенуированных штаммов вируса полиомиелита: тип I - Lsc 2ab, тип II - P 712 Ch 2ab, тип II - Leon 12 a1b. Стабилизатор - раствор магния хлорида. Консервант - канамицина сульфат 15 мкг в 1 дозе. Прозрачная жидкость красновато-оранжевого цвета без осадка и посторонних примесей.

Препарат предназначен для активной профилактики полиомиелита у детей в соответствии с прививочным календарем и по эпидпо-казаниям лицам, имевшим контакт с больным полиомиелитом.

Способ применения и дозировка. Вакцину вводят перорально по 2 (0,1 мл) или 4 (0,2 мл) капли на прием. Ее капают в рот стерильной пипеткой, капельницей или шприцем за 1 ч до еды. Запивать вакцину, есть и пить в течение 1 ч после прививки на разрешается. Прививки начинают с 3-месячного возраста трехкратно с интервалом 6 нед; ревакцинация - в 18 и 20 мес, а также в 14 лет. Вакцина формирует длительный иммунитет к вирусу полиомиелита типов I, II, III у 90% привитых. Вакцина сочетается со всеми другими вакцинами.

Реакция на введение. Вакцина, как правило, не вызывает никаких реакций, осложнения крайне редки: сыпь, крапивница, отек Квинке.

Вакциноассоциированный полиомиелит встречается как у привитых (4-30-е сут), так и у лиц, контактировавших с привитыми (до 60 сут после контакта). Риск развития вакциноассоци-ированного полиомиелита у вакцинированного оценивается частотой 1 : 500 тыс. - 1 : 1 млн первых доз и 1 : 6-12 млн повторных доз. Риск развития вакциноассоциированного полиомиелита по контакту с вакцинированным ребенком в семье ничтожен (1 : 14 млн). Форма выпуска. Флаконы по 2,0 мл (10 доз) или 5,0 мл (25 или 50 доз).

Вакцина «Имовакс Полио» («Авенсис Пастер», Франция) (вакцина Солка)

Состав препарата, назначение, показания к применению. Вакцина производится из вирусов полиомиелита I, II и III

типов, культивируемых на клеточной линии ВЕРО и инактивированных формалином. Консервант - 2-феноксиэтанол. Препарат предназначен для активной профилактики полиомиелита у лиц, которым противопоказана вакцина полиомиелитная пе-роральная (больные иммунодефицитом - первичным, лекарственным, ВИЧ-инфицированные), а также у тех, в семье которых есть такие больные. В ряде стран, где полиомиелит ликвидирован, массовая вакцинация проводится инактивированной вакциной с целью избежать вакциноассоциированного полиомиелита. Живая и инактивированная полиомиелитные вакцины взаимозаменяемы.

Способ применения и дозировка. Препарат вводят внутримышечно в дозе 0,5 мл детям с 3-месячного возраста трехкратно с интервалами в 1 мес, первую ревакцинацию проводят через год, последующие ревакцинации - каждые 5-

10 лет.

Реакция на введение. Инактивированные вакцины могут вызвать реакции у лиц с аллергией к стрептомицину.

Форма выпуска. 1 шприц или 1 ампула, содержащие 1 дозу вакцины; 10 шприцев по 1 дозе вакцины; 20 шприцев или 20 ампул по 1 дозе вакцины.

57. Поясните суть реакции гемагглютинации (РГА), поставленной с целью индикации вирусов гриппа, проведите её учет.

Реакция гемагглютинации - феномен склеивания эритроцитов под воздействием вирусов. Позитивная реакции - осадок в виде "зонтика", негативная - в виде "пуговицы".

Индикацию вируса гриппа осуществляют в реакции гемагглютинации (РГА) путем добавления 0,5 мл 1% суспензии отмытых эритроцитов кур к 0,5 мл вируссодержащего материала. Результаты РГА учитывают после 30-минутного оседания эритроцитов в лунках панелей при комнатной температуре.

При отсутствии агглютинации эритроцитов необходимо провести 3 дополнительных пассажа путем заражения эмбрионов смесью амниотической и аллантоисной жидкостей от предыдущего пассажа. В случае отрицательных результатов РГА после 3-х пассажей исследование материалов прекращают.

57. Поясните суть реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и проведите учет ее результатов прип идентификации вирусов гриппа.

Идентификацию вирусов гриппа проводят в РТГА.

Для этого к 0,2 мл последовательных разведений типоспецифических иммунных сывороток добавляют по 0,2 мл рабочей дозы вируса в количестве 4 гемагглютинирующих единиц (ГЕ). Одной ГЕ считают последнее разведение вируса, дающее отчетливую гемагглютинацию. После 1-часового контакта сыворотки с вирусом при комнатной температуре в каждую лунку добавляют по 0,4 мл 1% взвести куриных эритроцитов. Титром сывороток считают ее последнее разведение, блокирующее 4 ГЕ вируса.

Типовую принадлежность вируса определяют по ингибиции гемагглютинации, которая должна быть зарегистрирована в разведении не менее, чем 1:20.

Выделение вирусов гриппа может быть осуществлено на чувствительных культурах клеток, чаще всего МДСК. Для этого в пробирки монослоем, отмытым физиологическим фосфатным буфером или раствором Хэнкса, вносят по 0,2 мл материала от больного. Через 1 ч адсорбции при 38 °С в культуры добавляют по 1,5 мл поддерживающей среды (199, Игла с антибиотиками) и помещают в термостат при 33°С.

Учет реакции торможения гемагглютинации

Для постановки реакции с целью определения неизвестного вируса или его антигенов в буферном растворе (0,2) делают двукратные разведения иммунной сыворотки (исходное разведение 1:10), а потом добавляют неизвестный антиген в объеме 0,2 мл (4-8 ГАО). Систему инкубируют в зависимости от свойств вируса при температуре 4 °С, 18 °С, 37 °С 1-18 час. Потом к комплексу добавляют двойной объем зависи эритроцитов. Пробирки или пластины инкубируют в течение 1-3 год при той же температуре к полному оседанию эритроцитов и оценивают результаты. Реакцию считают позитивной при отсутствии агглютинации эритроцитов. РТГА широко используют для идентификации вирусов гриппа, паротита, енцефалитив и др.

Для реакции торможения гемагглютинации готовят двукратные разведения исследуемой сыворотки и в каждую лунку вносят рассчитанный объем разведенной вирусной суспензии, содержащей 4 (а иногда только 2) гемагглютинирующие единицы вируса. После этого в каждую лунку добавляют 1%-ную суспензию эритроцитов и материал инкубируют в течение 30 минут. Агглютинация клеток в лунках с высоким разведением свидетельствует о том, что содержащиеся в сыворотке данного разведения антитела не могут нейтрализовать агглютинирующей активности вируса. И, наоборот, при низких разведениях сыворотки эритроциты образуют плотный осадок на дне лунки; конечную точку титрования выбирают между этими крайними значениями. Следует заметить, что перед проведением реакции торможения гемагглютинации сыворотку нужно обработать для удаления неспецифических ингибиторов вирусной гемагглютинации. Эти ингибиторы, по-видимому, относятся к мукопротеинам и разрушаются после обработки сыворотки фильтратом культуры Vibrio choleras или метаперйодатом калия.

59. Учет РТГА

Типирование вируса проводят в реакции РТГА с набором типоспецифических сывороток.Результаты реакции учитывают по отсутствию гемагглютинации. Подтипы вируса типа А с антигенами H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 и другие могут быть дифференцированы в РТГА с набором гомологичных типоспецифических сывороток

Рис. 9. Результаты РТГА при типировании вируса гриппа

Условные обозначения: - торможение гемагглютинации (пуговка) ; - гемагглютинация (зонтик).

Выводы: Исследуемый материал содержит вирус гриппа тип А с антигеном H3N2

60. Специфическая профилактика бешенства.

Специфическая иммунопрофилактика бешенства проводится в плановом порядке и по эпидемическим показаниям при укусах, оцарапании и ослюнении домашними или дикими животными, которые необходимо рассмотреть как подозрительными на заражение бешенством.

При обращении в лечебно-профилактические или в амбулаторно-поликлинические учреждения лиц, укушенных, оцарапаных, ослюненных любыми домашними или дикими животными, а также людей, пострадавших при вскрытии трупов павших от бешенства животных или при вскрытии трупов людей, умерших от бешенства, медицинские работники этих учреждений, должны немедленно сообщить о случившемся в регионарный центр гигиены и эпидемиологии по телефону, а затем послать экстренное извещение (ф. №05 8/у). Пострадавшему в медицинских учреждениях необходимо немедленно оказать первую медицинскую помощь. Местная обработка раны не исключает

необходимости проведения иммунопрофилактики бешенства, а также проводится экстренная профилактика столбняка, как при других травмах, если пострадавший не был привит против этой инфекции ранее. Собаки, кошки и другие животные, покусавшие людей или животных, должны быть доставлены владельцем этих животных, организацией, хозяйством или специальной бригадой по отлову бродячих животных в ближайшее лечебное ветеринарное учреждение для осмотра и карантинизации в течение 10 дней под наблюдением специалистов. В некоторых случаях, как исключение, при наличии хорошо огражденного двора или надежно закрывающихся помещений, исключающих контакт с другими животными, по разрешению ветеринарных учреждений животные, покусавшие людей или животных, могут быть оставлены под расписку у владельца этого животного. Владелец животного должен содержать его на надежной привязи в изолированном помещении в течение 10 дней и представлять для ветеринарного осмотра в сроки, указанные ветеринарным врачом, наблюдающим за животным.

По эпидемическим показаниям иммунопрофилактику против бешенства пострадавшим людям проводят в травматологических пунктах (кабинетах), а где их нет - в хирургических кабинетах. В этих учреждениях, руководители их, выделяют для этих целей специально подготовленных врачей травмотологовортопедов или хирургов, для которых в графике их работы предусматривается время для проведения иммунопрофилактики бешенства.

Для лечебно-профилактической или профилактической иммунизации людей применяется вакцина антирабическая культуральная концентрированная очищенная инактивированная сухая (КОКАВ), которая индуцирует выработку иммунитета против бешенства.

КОКАВ представляет собой вакцинный вирус бешенства штамм Внуково-32, выращенный в первичной культуре клеток сирийских хомячков, инактивированный ультрафиолетовыми лучами и формалином, концентрированный и очищенный.

Препараты, применяемые для профилактики бешенства

Вакцина антирабическая культуральная инактивированная сухаярабивак-Внуково-32 (КАВ)

Состав препарата, назначение, показания к применению. Вакцина представляет собой культуру производственного штамма вируса бешенства Внуково-32, выращенного на первичной культуре клеток почек сирийских хомячков, инактивированную ультрафиолетовыми лучами и формалином. Стабилизаторы - желатоза и сахароза. Пористая масса в виде таблетки светло-желтого цвета с розоватым оттенком. Применяется для лечебно-профилактической и профилактической иммунизации людей. Вакцина индуцирует выработку иммунитета против бешенства.

Способ применения и дозировка. Непосредственно перед применением в ампулу с вакциной вносят 3 мл растворителя. Препарат вводят в разные участки подкожной клетчатки живота, отступив от средней линии на 2-3 пальца, на уровне или ниже пупка.

Реакция на введение. После введения вакцины могут развиться местные и общие реакции. Местная реакция в легких случаях выражается в гиперемии, возникающей через несколько часов после прививки и исчезающей через 2-3 ч. В других случаях на 5-7-е сут образуется уплотнение диаметром 5 см и более с гиперемией, зудом, а также увеличением регионарных лимфатических узлов. Прививке могут сопутствовать общее недомогание и субфебрилитет. У повторно прививаемых подобные реакции наблюдаются чаще и в более ранние сроки. Перерыв в прививках на 1-2 дня и прием внутрь жаропонижающих и антигистаминных средств способствуют исчезновению симптомов. Вакцинированный должен находиться под медицинским наблюдением не менее 30 мин.

Форма выпуска. Ампулы по одной прививочной дозе (3 мл). Упаковка содержит 5 ампул вакцины и 5 ампул растворителя.

Вакцина антирабическая культуральная концентрированная очищенная инактивированная сухая (КОКАВ)

Состав препарата, назначение, показания к применению. Вакцина представляет собой культуру производственного штамма вируса бешенства Внуково-32, выращенного на первичной культуре клеток почек сирийских хомячков, концентрированную и очищенную методами ультрафильтрации и ультрацентрифугирования, инактивиро-ванную ультрафиолетовыми лучами и формалином. Пористая масса в виде таблетки розовато-белого цвета. Стабилизатор - сахароза. Применяется для лечебно-профилактической и профилактической иммунизации людей. Вакцина индуцирует

выработку иммунитета против бешенства. Показания для лечебно-профилактической иммунизации: контакты и укусы людей бешеными, подозрительными на бешенство или неизвестными животными. С профилактической целью иммунизируют лиц, профессиональная деятельность которых связана с риском заражения: сотрудников лабораторий, контактирующих с уличным вирусом бешенства, ветеринаров, охотников, лесников, собаколовов, работников боен.

Способ применения и дозировка. Непосредственно перед применением в ампулу вносят 1 мл растворителя. Растворенную вакцину вводят медленно в дельтовидную мышцу. Детям до 5 лет - в мышцу бедра (верхняя часть переднебоковой поверхности). Никогда не следует вводить вакцину в ягодичную область.

С лечебно-профилактической целью вакцину вводят по схеме на 0, 3, 7, 14, 30 и 90-е сут (табл. 17). С профилактической целью первичный курс прививок состоит из трехкратного введения одной дозы вакцины на 1, 7 и 30-е сут. Первую ревакцинацию проводят через год однократно, последующие - каждые 3 года.

Реакция на введение. После введения вакцины могут развиться местные и общие реакции. Местная реакция в легких случаях выражается в гиперемии, возникающей через несколько часов после прививки и исчезающей через 2-3 ч. В других случаях на 5-7-е сут образуется уплотнение диаметром 5 см и более с гиперемией, зудом, а также увеличением регионарных лимфатических узлов. Прививке могут сопутствовать общее недомогание и субфебрилитет. У повторно прививаемых подобные реакции наблюдаются чаще и в более ранние сроки. Перерыв в прививках на 1-2 сут и прием внутрь жаропонижающих и антигистаминных средств способствуют исчезновению симптомов. Вакцинированный должен находиться под медицинским наблюдением не менее 30 мин.

Форма выпуска. Ампулы по одной прививочной дозе (1 мл). Упаковка содержит 5 ампул вакцины и 5 ампул растворителя.

В России зарегистрирована инактивированная антирабическая вакцина «Рабипур» («Кайрон Беринг», Германия). Вакцина представляет собой штамм вируса бешенства Flury LEP, выращенный на культуре куриных фибробластов, инактивированный р-пропиолак-тоном и концентрированный путем зонального центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Вакцину вводят внутримышечно в дельтовидную мышцу, детям раннего возраста - в переднебоковую поверхность бедра в дозе 1 мл независимо от возраста.

Форма выпуска. 1 флакон с лиофилизированным порошком (1 доза) и 1 ампула с 1 мл воды для инъекций.