3 курс / Микробиология / Лекции / 31_Virusy_beshenstva
.docx
ТЕМА № 31 "ВИРУСЫ БЕШЕНСТВА, КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА"
Вирусологическая диагностика бешенства
Вирус бешенства входит в семейство Rabdoviridae, род Lyssavirus (от греч. «Lissa» - водобоязнь, гидрофобия).
Исследуемый материал: ткань мозга (постмортальная диагностика), слюна, спинномозговая жидкость, слёзная жидкость, биоптаты кожи, отпечатки роговицы (прижизненная диагностика).
Используют методы: микроскопический, вирусологический.
Микроскопический метод. Готовят мазки-отпечатки и срезы мозга (кора больших полушарий, мозжечок, продолговатый мозг и амонов рог). Препараты окрашивают по методу Туревича, Манна, Романовского, Морозова, Муромцеву-Селлеру и микроскопируют иммерсионной системой микроскопа, выявляя специфические тельца Бабеша-Негри в цитоплазме клеток. Тельца Бабеша-Негри имеют различную величину, форму и внутреннюю структуру. Чаще встречаются тельца круглой или овальной формы размерами от 4 до 10мкм. Они окружены оболочкой. Тельца Бабеша-Негри могут отсутствовать в клетках, если инкубационный период был коротким или проводилась вакцинация.
РИФ. Мазки-отпечатки ткани мозга фиксируют в ацетоне (t+4С°). На препараты наносят специфический иммуноглобулин, меченый ФИТЦ (флуоресцеинаизотиоционат) и рассматривают под люминесцентным микроскопом. Антигены вируса бешенства определяются в виде зелёных гранул разной формы и величины.
Вирусологический метод. Исследуемый материал обрабатывают. Если он плотный, готовят 10% взвесь из ткани. Исследуемый материал вводят в мозг белым мышам. При наличии вируса бешенства возникает экспериментальная инфекция, которая сопровождается параличами и смертью, а в ткани мозга выявляются тельца Бабеша-Негри. Наличие вируса бешенства в тканях погибших животных подтверждают в РИФ или ИФА.
Идентификацию обнаруженного вируса проводят в реакции нейтрализации на мышах с помощью антирабического иммуноглобулина.
Диагностика клещевого энцефалита
Возбудитель клещевого энцефалита входит в семейство Flaviviridae, Flavivirus.
Исследуемый материал: кровь, плазма, сыворотка крови, ликвор больных, мозг умерших, а также материал из природных очагов: клещи, мозг и внутренние органы диких животных, молоко коз.
Используют методы диагностики: экспресс-метод, вирусологический, серологический.
Экспресс-метод. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) – высокочувствительна, специфична и позволяет быстро обнаружить вирусы клещевого энцефалита в культурах клеток сирийского хомячка, клеток почки зелёной обезьяны, клеток фибробластов эмбрионов кур. На культуры клеток указанных линий, обработанные исследуемым материалом, наносят люминесцентную сыворотку, содержащую специфические к арбовирусам антигенам антитела, меченные флюорохромом (изотиоциоционатом флуоресцеина) облучение препарата коротковолновым светом (ультрафиолетовым, фиолетовым, синим) даёт зеленовато-желтое свечение при наличии вируса.
Иммуноферментный анализ (ИФА) – широко используется для обнаружения в исследуемом материале вирусных антигенов, так как обеспечивает высокую специфичность и чувствительность, не требует предварительной обработки материала и позволяет получить ответ в течение 3-4 часов.
На поверхности лунок полистироловой планшетки адсорбируют специфические к вирусам клещевого энцефалита антитела. В такие лунки вносят суспензию исследуемого материала. Если в нём есть антигены данного вируса, то образуется комплекс антитело + антиген. Далее в лунки вносят специфические антитела, меченные ферментом (пероксидазой). На поверхности твёрдой фазы (стенки лунки) формируется комплекс: антитело + антиген + меченное антитело. Результаты реакции учитывают после прибавления в лунки субстрата (ортофенилендиамина с перекисью водорода) для выявления метки (пероксидазы). Появление жёлтого цвета свидетельствует о присутствии антигена вируса клещевого энцефалита.
Реакция обратная пассивной гемагглютинации (РОПГА) даёт возможность установить наличие вируса в исследуемом материале без предварительного накопления. Принцип реакции лежит во взаимодействии антител к вирусам клещевого энцефалита, сорбированных на поверхности эритроцитов с гомологичным антигеном, в результате чего происходит агглютинация сенсибилизированных эритроцитов.
Диагностика клещевого энцефалита
Вирусологический метод базируется на обнаружении (индикация) вируса в исследуемом материале и последующей идентификации. Индикация осуществляется путём:
1. введения обработанного антибиотиками исследуемого материала в мозг 1-2 дневных белых мышей. Положительный результат – заболевание животных.
Для накопления вируса в исследуемом материале проводят предварительное культивирование в курином эмбрионе с последующим введением аллантоисной жидкости белым мышам.
2. Введения обработанного антибиотиками исследуемого материала в культуру клеток (первично-трипсинизированная культура клеток почки эмбриона свиньи). Присутствие вируса в исследуемом материале регистрируют по цитопатическому действию (ЦПД), цветной пробе (ЦП).
Идентификация осуществляется с помощью специфической диагностической сыворотки, содержащей вируснейтрализующие антитела в реакции нейтрализации на белых мышах, в реакции нейтрализации цитопатического действия, цветной пробы.
Серологический метод. Определяют антитела к вирусу энцефалита в сыворотках крови больного с помощью известного антигена (диагностикума). Для этого используют реакцию нейтрализации цитопатического действия, реакцию нейтрализации цветной пробы, реакцию торможения гемагглютинации, реакцию связывания комплемента.
Диагностическое значение имеют исследования парных сывороток с выявлением нарастания титра антител так как в очагах клещевого энцефалита могут быть иммунные особи вследствие перенесенной инфекции или прививки вакциной против клещевого энцефалита.