южноафриканская шпорцевая лягушка Xenopus laevis.
раннее развитие у нее протекает в три раза быстрее.
английский биолог
Джон Гердон
(1962)
ВПЕРВЫЕ 1. в качестве донора ядер использовал не зародышевые клетки,
а специализировавшиеся клетки эпителия кишечника головастика.
2. Ядра яйцеклеток реципиентов разрушал ультрафиолетовыми лучами.
|
УФО |
Реконструированные |
|
Яйцеклетки (РЯ) |
|
6,5% |
из этих эмбрионов достигали стадии бластулы, |
|
2,5% |
- стадии головастика и только 1% развился в половозрелых особей. |
|
Гердон и Ласки (1970) стали культивировать in vitro клетки почки, легкого
и кожи взрослых животных и использовать уже эти клетки в качестве доноров ядер.
25% первично РЯ развивались до стадии бластулы |
|
При серийных пересадках - до стадии плавающего головастика |
11 |
П
Е
Р
В
О
Е
К
Л
О
Н
И
Р
О
В
А
Н
И
Е
111-я Нобелевская неделя. Нобелевской премией по физиологии и медицине отмечены исследования в области перепрограммирования клеток и клонирования Нобелевская премия по физиологии и медицине 2012 года вручена англичанину
ДЖОНУ ГЁРДОНУ (JOHN GURDON)
и японцу СИНЬЕ ЯМАНАКЕ (SHINYA YAMANAKA), открывшим возможность перепрограммирования зрелых клеток в плюрипотентные.
Сокращенная схема (выпущены серийные трансплантации ядер) получения клонированной лягушки. [Г.В. Лопашов,
Бриггс, Кинг; Д.Гердон ]
донор ядер 
в- клонированная лягушка (из клеток плавательной перепонки донора) 13
2. Перенос ядер в яйцеклетки млекопитающих
Предпосылки:
1.Изучены ранние этапов эмбриогенеза мышей и кроликов;
2. Разработаны технологии микроманипуляций
СТАНДАРТНЫЕ МЕТОДЫ ТРАНСФОРМАЦИИ КЛЕТОК
1.Бомбардировка или баллистическая трансформация.
2.Трансформация с использованием вирусов.
3.Электропорация
Первое заявление о получении живой мыши после пересадки ядра -
Карл Ильменси (ILLMENSEE) в 1977
Результаты признали недостоверными
Объем яйцеклетки амфибий в 1000 раз больше объема ооцита плацентарных
14
Пронуклеус - одно из двух гаплоидных ядер в яйце млекопитающих
впериод после проникновения сперматозоида, но до слияния мужского и женского пронуклеусов
вядро зиготы в процессе оплодотворения.
1984 г. МакГрат и Солтер |
энуклеированные зиготы |
Метод удаления обоих пронуклеусов из зигот мышей с помощью стеклянной микропипетки.
ядра 8-клеточных зародышей не обеспечивают развитие даже до стадии морулы,
5% ядер 4-клеточных зародышей - до стадии морулы.
19% ядер 2-клеточных зародышей -стадии морулы или бластоцисты
в эмбриогенезе у мышей клеточные ядра рано теряют тотипотентность,
что связано с очень ранней активацией генома зародыша
( на стадии 2-х клеток). |
15 |
|
Р
Е
П
Р
О
Д
У
К
Т
И
В
Н
О
Е
•Открытие Гердона и его сотрудников – клонирование лягушки (50-ые – 60-ые годы).
•Трудности и неудачи в попытках пересадки ядер у млекопитающих(70-ые-80-ые годы).
•Главная причина в том, что у млекопитающих объем ядра в 1000 и более раз меньше, чем у рыб и амфибий.
•Обнадеживающие результаты Ильменси и Хоппе(1977, 1981) и их опровержение в работе Мак-Грасса и Солтера (1983).
К
Л
О
Н
И
Р
О
В
А
Н
И
•Главные находки на пути совершенствования метода пересадки ядер:
•Предложение Ильменси и Хоппе добавлять в среду культивирования цитохалазин Б или Д (1979).
•Предложение Мак-Грасса и Солтера метода энуклеации зиготы без прокола поверхностной мембраны (1983).
•Предложение использовать метод
Еэлектостимулируемого слияния клеток для переноса чужеродного генома в энуклеированную16
зиготу
у кроликов, овец и крупного рогатого скота, активация первой группы генов
в эмбриогенезе происходит позднее, на 8-16-клеточной стадии.
Стик и Робл (США),
используя методику МакГрата и Солтера,
получили 6 живых кроликов, пересадив ядра 8клеточных эмбрионов
одной породы в лишенные ядра яйцеклетки кроликов другой породы.
Фенотип родившихся полностью соответствовал фенотипу донора.
Однако только 6 из 164 РЯ (3,7%) развились в нормальных животных.
Уиладсин в 1986 году показал, что и у эмбрионов овец на 16-клеточной стадии
развития ядра сохраняют тотипотентность.
17
1996 год - 7 марта первая статья Ян Вилмута и коллектива авторов из института
Рослин в Эдинбурге
1997 год - 27 февраля на фоне микрофотографии яйцеклетки овечку Долли
18
I. 1.Донорские клетки выделяли из эпителия молочной железы сукотной шестилетней овцы породы Finn Dorset (финский дорсет)
2.Клетки эпителия молочной железы выращивали в "бедной" питательной среде (содержащей в 5 раз меньше концентрации всех компонентов).
3. ядра дифференцированных клеток полностью |
|
переходили в неактивное состояние |
|
-способ репрограммирования ДНК соматических клеток |
|
- в дефицитной питательной среде |
19 |
II. 4. С помощью суперовуляции получали десятки неоплодотворенных
яйцеклеток овцы породы Scottish Blackface (шотл. черномордая)
5.Из яйцеклеток с помощью микроманипулятора удаляли пронуклеус.
6. Яйцеклетку без ядра II и
эпителиальную "голодную" клетку I присасывали к концу микропипетки
7. Когда две клетки образовывали плотный контакт, пропускали электрический разряд.
1-й электроразряд применялся для слияния двух клеток. 2-й электрозаряд был необходим для запуска дробления клетки.
20