Биология / Лекции Щербатюк Т.Г / 13. Генная инженерия(самоподготовка)
.pdfЭтапы методов генной инженерии
1.Получение генетического материала
2.В ДНК, способную реплицироваться автономно (вектор) ферментативно встраивают фрагменты ДНК
из любого источника
3.Получаемые при этом молекулы гибридной ДНК
вводят в E.coli
4.в E.coli рекомбинантные молекулы ДНК реплицируются, размножая в своем составе клонируемый фрагмент ДНК
5.Полученные гибридные ДНК подвергают дальнейшим перестройкам и затем вводят в реципиентные клетки,
изменяя их генотип и фенотип |
21 |
|
2 Э. векторы – кольцевые молекулы ДНК -молекула-переносчик.
Свойства векторных молекул:
1. Способны к саморепликации
(содержат ori репликации=Origin-точка начала репликации)
2. Содержат сайты рестрикции.
По одному из этих сайтов вектор расщепляется и смешивается с изучаемым фрагментом ДНК
3.Содержат маркеры, по которым можно вести отбор клеток (отсутствуют в клетках хозяина)
4.Легко извлекаются из клеток хозяина
22
2 Э. векторы – кольцевые молекулы ДНК -молекула-переносчик.
Первые векторы созданы на основе плазмид.
Первый векторплазмида pSC101
(размер: 9100 п.н., 6 копий на нуклеотид),
Детерминирует устойчивость к тетрациклину, есть 1 сайт расщепления для рестриктазы EcoRl
23
Липкие концы ДНК
Рекомбинация in vitro
плазмида
Маркер устойчивости к антибиотику
Рекомбинантная
плазмида
Введение в бактериальные клетки
Отбор клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК, по способности расти в присутствии антибиотика
Рис. Клонирование фрагмента ДНК в плазмиде (Лещинская И.Б., 1996) |
24 |
Для клонирования крупных фрагментов ДНК используют ФАГОВЫЕ ВЕКТОРЫ, КОСМИДЫ, ФАЗМИДЫ.
ФАГОВЫЕ |
КОСМИДЫ |
ФАЗМИДЫ |
|
ВЕКТОРЫ |
|
|
|
|
|
|
|
фаг лямбда = 2 цепоч. |
Плазмиды, |
Гибридные векторы, |
|
ДНК (48500 п.н. |
содержащие липкие |
способные |
|
упакована в головку в |
концы ДНК (cos- |
развиваться и как |
|
виде линейной |
участки) фага лямбда. |
фаг, и как плазмида, |
|
молекулы с 1 нитевыми |
М.б. введены в клетку |
т.к. содержат все |
|
комплементарными |
путем обычной |
гены, необходимые |
|
концами (липкие концы). |
инфекции. |
для литического |
|
После проникновения |
Клонируют |
цикла, а также, |
|
в клетку липкие концы |
фрагменты ДНК |
нужные для |
|
репликации |
|||
взаимно спариваются, |
размером 33-39 тыс. |
||
плазмиды. |
|||
молекула замыкается в |
п.н. ==\ предназначены |
||
кольцо и сшивается |
для встраивания |
|
|
лигазой. |
крупных генов и |
емкостьФ.<К=ФВ |
|
Клонируют 15 тыс.п.н. |
создания клонотек |
|
|
|
генов эукариот |
25 |
|
|
|
|
Для клонирования крупных фрагментов ДНК используют
ФАГОВЫЕ ВЕКТОРЫ
фаг лямбда = 2 цепоч. ДНК
(48500 п.н. упакована в головку в виде линейной молекулы с 1 нитевыми комплементарными
концами (липкие концы)).
После проникновения в клетку липкие концы взаимно спариваются, молекула замыкается в кольцо и сшивается лигазой.
Клонируют 15 тыс.п.н.
26
КОСМИДЫ
Плазмиды, содержащие липкие концы ДНК (cos-участки) фага лямбда.
М.б. введены в клетку путем
обычной инфекции.
Клонируют фрагменты ДНК размером 33-39 тыс. п.н. ==\ предназначены для встраивания крупных генов и создания клонотек генов эукариот
27
ФАЗМИДЫ
Гибридные векторы, способные развиваться и как фаг, и как плазмида, т.к. содержат все гены,
необходимые для
литического цикла, а также, нужные для репликации плазмиды.
емкостьФ.<К=ФВ
28
Этапы методов генной инженерии
1.Получение генетического материала
2.В ДНК, способную реплицироваться автономно (вектор) ферментативно встраивают фрагменты ДНК
из любого источника
3.Получаемые при этом молекулы гибридной ДНК
вводят в E.coli
4.в E.coli рекомбинантные молекулы ДНК реплицируются, размножая в своем составе клонируемый фрагмент ДНК
5.Полученные гибридные ДНК подвергают дальнейшим перестройкам и затем вводят в реципиентные клетки,
изменяя их генотип и фенотип |
29 |
|
3Э. Введение рекомбинантных ДНК в клетку-реципиент и включение ее в хромосомный аппарат
Конъюгация-передача генетического материала у бактерий при прямом межклеточном контакте.
Передача фактора F (плазмида размером 60 тыс. п.н.) из одной клетки в другую
трансдукция-передача ДНК от клетки донора клетке реципиенту при участии бактериофагов
Трансфекцияинфекция фагами лямбда, Т4, соответствующая трансформации
30