Тонкослойная хроматография (тсх)

Тонкослойная хроматография — один из наиболее простых и эффективных экспресс-ме­тодов разделения и анализа веществ в биосредах, пищевых продуктах и других сложных системах и биоматериалах, не требующий сложного оборудования и доступный для поста­новки в любых условиях. В то же время этот метод обладает высокой избирательностью и чувствительностью.

В зависимости от природы неподвижной фазы ТСХ может быть адсорбционной, распре­делительной и аффинной. Ниже рассмотрен весьма широко применяемый адсорбционный вариант ТСХ.

Процесс разделения в этом варианте основан на различии в относительном сродстве компо­нентов смеси к неподвижной фазе — сорбенту и осуществляется в результате перемещения под­вижной фазы — элюента — под действием капиллярных сил по слою сорбента, нанесенного на хроматографическую пластинку из инертного материала (стекло, алюминиевая фольга и др.).

Скорость перемещения вещества при хроматографировании в стандартных условиях яв­ляется постоянной величиной, характерной для данного соединения. Ее оценивают величиной R_f, которая в любой момент времени представляет собой отношение рассто-

яния от стартовой линии хроматограммы до центра пятна этого вещества (/) к расстоянию, пройденному за то же время фронтом растворителя (I).

Ассортимент используемых сорбентов в настоящее время достаточно велик. Это — уни­версальные сорбенты (силикагель, оксид алюминия, целлюлоза), полиамиды, крахмал, ки­зельгур, гипс, агар-агар, сульфат кальция, карбонат цинка и др. Главное требование к сор­бентам — отсутствие химического взаимодействия с анализируемым веществом.

Для приготовления подвижной фазы с высокой элюирующей способностью использу­ют смесь растворителей разной полярности.

В большинстве случаев пробы анализируемых веществ наносят в виде растворов в под­ходящем низкокипящем растворителе. Нанесение образца осуществляется при помощи ка­либрованных микропипеток или с помощью обычного стеклянного капилляра на расстоя­нии 1,5-2,0 см от нижнего края хроматографической пластинки в виде серии пятен вдоль линии старта. Диаметр наносимого пятна должен быть как можно меньше, так как по мере развития хроматограммы он обычно увеличивается вследствие диффузии.

В зависимости от того, в каком направлении поступает растворитель на пластинку, раз­личают методы восходящей, нисходящей и горизонтальной хроматографии. Чаще всего ис­пользуют восходящий вариант: растворитель поднимается по пластинке вверх под действи­ем капиллярных сил. При этом в токе элюента перемещаются также и исследуемые вещества со скоростью, зависящей от их адсорбционных свойств. Когда фронт элюента достигнет вер­хней части сорбента, хроматографическое разделение заканчивается. Нельзя допускать со­прикосновения фронта растворителя с верхним краем пластинки, так как в этом случае рас­чет Rf становится невозможным.

Окрашенные вещества не требуют специального обнаружения. Большинство же хрома-тографируемых соединений бесцветно, и поэтому существуют различные методы их иден­тификации, а именно — физические (УФ облучение), химические (обработка хроматограмм газами, например, аммиаком, парами иода, брома или опрыскивание различными обнаружи­вающими реагентами, что вызывает появление специфического окрашивания разделяемых компонентов в результате их реакции с действующим реагентом) и биологические (для био­логически активных соединений).

Идентификация веществ осуществляется по стандартным значениям величин R_f (дан­ные литературы) или по методу «свидетелей» (проведение параллельного хроматографиро-вания смеси неизвестного состава и индивидуальных соединений, присутствие которых в ис­следуемой пробе предполагается, с последующим сравнением величин R_f). Следует помнить, что величина R_f может быть использована для идентификации, только при указании элю-ента и адсорбента, с помощью которых проводился анализ.

ТСХ перестает быть качественным методом исследования, когда с помощью какой-либо аппаратуры (спектрофотометров, фотоэлектроколориметров и др.) выполняют количествен­ное определение концентраций веществ после разделения смесей.

Метод ТСХ позволяет медикам проводить определение токсинов, осуществлять диагно­стику отравлений, исследовать продукты метаболизма токсичных веществ в биологических средах (кровь, моча, слюна).

Преимущества тонкослойной хроматографии, а именно: минимальное время, необходи­мое для подготовки пробы, высокая разрешающая способность и чувствительность — позво­ляют врачу в кратчайшие сроки провести не только дифференциальную диагностику при острых химических отравлениях, но и следить при лечении больного за детоксикацией орга­низма, давая в руки клинициста надежный инструмент токсикокинетического контроля. Врач, получая данные о результатах качественного определения анализируемых компонентов в крови или другой биологической жидкости, имеет возможность правильно оценить резуль­таты лечения, эффективность применяемых методов, установить необходимую длительность проведения операций, перитонеального диализа и хирургических методов детоксикации (ге­модиализа, гемосорбции).