ХРОМАТОГРАФИЯ В МЕДИЦИНЕ
Любую разновидность хроматографии можно определить как физико-химический метод разделения смесей веществ, основанный на их распределении между двумя несмешивающимися фазами, одна из которых является неподвижной, а другая — подвижной.
Неподвижная фаза представляет собой поверхностно-активное твердое тело или жидкость, закрепленную на поверхности инертного твердого носителя. Подвижная фаза — газ или жидкость, которые проходят через слой неподвижной фазы.
Метод был открыт в 1903 году М. С. Цветом, который впервые применил его для разделения пигментов листьев растений. Вот как оценил один из английских химиков открытие Цвета: «...был предложен новый остроумный метод химического анализа, которому предназначено оказать влияние на жизнь человечества и всего живого мира».
В адсорбционной хроматографии процесс разделения основан на различии в относительном сродстве соединений к твердому адсорбенту (неподвижная фаза), а подвижной фазой служит жидкость (колоночная адсорбционная или тонкослойная хроматография) или газ (газовая адсорбционная хроматография).
В распределительной хроматографии вещества распределяются между двумя жидкими фазами (жидкостная распределительная хроматография) или между неподвижной жидкой и газовой фазами (газо-жидкостная хроматография). В жидкостной хроматографии неподвижная фаза может представлять собой пленку или слой (хроматография на бумаге или тонкослойная распределительная хроматография) или может быть диспергирована на объемном носителе (колоночная распределительная хроматография).
В основе ионообменной хроматографии лежит обратимый обмен ионов, содержащихся в растворе, на подвижные ионы ионитов или ионообменников.
При разделении веществ методом гель-хроматографии в качестве стационарной фазы используют различные гели с трехмерной сетчатой структурой: цеолиты (называемые иначе молекулярными ситами), пористые силикагели, декстраны и некоторые другие полисахариды, синтетические полиакриламидные гели и др. В процессе разделения небольшие молекулы смеси диффундируют через поры набухшего в растворителе геля, а крупные молекулы перемещаются через пространство между частицами геля. При промывании геля растворителем в первую очередь из хроматографической колонки выходят крупные молекулы, а затем мелкие, т.е. компоненты смеси элюируются в порядке уменьшения их молекулярной массы. Основная область применения гель-хроматографии — очистка и выделение ферментов и других полипептидов, а также нуклеиновых кислот.
Особняком в ряду других хроматографических методов стоит аффинная или биоспецифическая хроматография. В ее основе лежит свойство высокомолекулярных и других биологически активных соединений «узнавать» в любой смеси «свои» строго определенные вещества и взаимодействовать с ними. Так, фермент «узнает» свой субстрат, антиген «узнает» антитело, гормон — «свой» рецептор и т.д.
Задачей хроматографического анализа является:
1. Идентификация нескольких компонентов в одном образце.
2. Удаление соединений, мешающих анализу другим методом.
3. Концентрирование компонента, присутствующего в виде следов в сложной смеси с целью его дальнейшего анализа.
4. Решение специальных задач, например, вопросов химического превращения компонентов (главным образом, токсических) в окружающей среде.
Методы тонкослойной (ТСХ), газожидкостной (ГЖХ) и высокоэффективной жидкостной (ВЭЖХ) хроматографии широко используются как рутинные методы анализа органических соединений во многих областях науки, включая медицину, и их значение постоянно возрастает.
Тонкослойная хроматография (ТСХ)
Тонкослойная хроматография — один из наиболее простых и эффективных экспресс-методов разделения и анализа веществ в биосредах, пищевых продуктах и других сложных системах и биоматериалах, не требующий сложного оборудования и доступный для постановки в любых условиях. В то же время этот метод обладает высокой избирательностью и чувствительностью.
В зависимости от природы неподвижной фазы ТСХ может быть адсорбционной, распределительной и аффинной. Ниже рассмотрен весьма широко применяемый адсорбционный вариант ТСХ.
Процесс разделения в этом варианте основан на различии в относительном сродстве компонентов смеси к неподвижной фазе — сорбенту и осуществляется в результате перемещения подвижной фазы — элюента — под действием капиллярных сил по слою сорбента, нанесенного на хроматографическую пластинку из инертного материала (стекло, алюминиевая фольга и др.).
Скорость перемещения вещества при хроматографировании в стандартных условиях является постоянной величиной, характерной для данного соединения. Ее оценивают величиной Rf, которая в любой момент времени представляет собой отношение рассто-
яния от стартовой линии хроматограммы до центра пятна этого вещества (/) к расстоянию, пройденному за то же время фронтом растворителя (I).
Ассортимент используемых сорбентов в настоящее время достаточно велик. Это — универсальные сорбенты (силикагель, оксид алюминия, целлюлоза), полиамиды, крахмал, кизельгур, гипс, агар-агар, сульфат кальция, карбонат цинка и др. Главное требование к сорбентам — отсутствие химического взаимодействия с анализируемым веществом.
Для приготовления подвижной фазы с высокой элюирующей способностью используют смесь растворителей разной полярности.
В большинстве случаев пробы анализируемых веществ наносят в виде растворов в подходящем низкокипящем растворителе. Нанесение образца осуществляется при помощи калиброванных микропипеток или с помощью обычного стеклянного капилляра на расстоянии 1,5-2,0 см от нижнего края хроматографической пластинки в виде серии пятен вдоль линии старта. Диаметр наносимого пятна должен быть как можно меньше, так как по мере развития хроматограммы он обычно увеличивается вследствие диффузии.
В зависимости от того, в каком направлении поступает растворитель на пластинку, различают методы восходящей, нисходящей и горизонтальной хроматографии. Чаще всего используют восходящий вариант: растворитель поднимается по пластинке вверх под действием капиллярных сил. При этом в токе элюента перемещаются также и исследуемые вещества со скоростью, зависящей от их адсорбционных свойств. Когда фронт элюента достигнет верхней части сорбента, хроматографическое разделение заканчивается. Нельзя допускать соприкосновения фронта растворителя с верхним краем пластинки, так как в этом случае расчет Rf становится невозможным.
Окрашенные вещества не требуют специального обнаружения. Большинство же хрома-тографируемых соединений бесцветно, и поэтому существуют различные методы их идентификации, а именно — физические (УФ облучение), химические (обработка хроматограмм газами, например, аммиаком, парами иода, брома или опрыскивание различными обнаруживающими реагентами, что вызывает появление специфического окрашивания разделяемых компонентов в результате их реакции с действующим реагентом) и биологические (для биологически активных соединений).
Идентификация веществ осуществляется по стандартным значениям величин Rf (данные литературы) или по методу «свидетелей» (проведение параллельного хроматографиро-вания смеси неизвестного состава и индивидуальных соединений, присутствие которых в исследуемой пробе предполагается, с последующим сравнением величин Rf). Следует помнить, что величина Rf может быть использована для идентификации, только при указании элю-ента и адсорбента, с помощью которых проводился анализ.
ТСХ перестает быть качественным методом исследования, когда с помощью какой-либо аппаратуры (спектрофотометров, фотоэлектроколориметров и др.) выполняют количественное определение концентраций веществ после разделения смесей.
Метод ТСХ позволяет медикам проводить определение токсинов, осуществлять диагностику отравлений, исследовать продукты метаболизма токсичных веществ в биологических средах (кровь, моча, слюна).
Преимущества тонкослойной хроматографии, а именно: минимальное время, необходимое для подготовки пробы, высокая разрешающая способность и чувствительность — позволяют врачу в кратчайшие сроки провести не только дифференциальную диагностику при острых химических отравлениях, но и следить при лечении больного за детоксикацией организма, давая в руки клинициста надежный инструмент токсикокинетического контроля. Врач, получая данные о результатах качественного определения анализируемых компонентов в крови или другой биологической жидкости, имеет возможность правильно оценить результаты лечения, эффективность применяемых методов, установить необходимую длительность проведения операций, перитонеального диализа и хирургических методов детоксикации (гемодиализа, гемосорбции).
Газо-жидкостная хроматография (ГЖХ)
Газо-жидкостная хроматография — универсальный метод разделения смесей разнообразных веществ, испаряющихся без разложения. Следовательно, ее возможности ограничены применимостью к анализу сравнительно низкомолекулярных веществ (с молекулярной массой не более нескольких тысяч).
При этом компоненты разделяемой смеси перемещаются по хроматографической колонке с потоком инертного газа {газа-носителя). Разделяемая смесь распределяется между газом-носителем (подвижной фазой) и нелетучим растворителем (неподвижной жидкой фазой), нанесенным на инертный материал (твердый носитель), которым заполнена колонка. Компоненты смеси селективно удерживаются неподвижной фазой, а затем выходят из колонки и регистрируются детектором. Сигналы детектора записываются в виде хроматограм-мы автоматическим потенциометром (самописцем). Каждому компоненту смеси на хроматог-рамме (рис. 17.2) соответствует отдельный пик. Положение пика определяется величиной времени удерживания (tR), которое представляет собой время от момента ввода пробы до выхода максимума пика, или величиной удерживаемого объема (VR), который рассчитывается по формуле:
VR = tR-F,
где F— объемная скорость газа-носителя.
Проведение анализа методом ГЖХ включает подготовительный этап работы, проведение хроматографического разделения и обработку результатов.
В подготовительном этапе работы необходимо нанести требуемую неподвижную фазу в виде тонкой пленки на твердый носитель. Полученным таким образом наполнителем заполняют хроматографическую колонку, представляющую собой свитую в спираль тонкую стеклянную или металлическую трубку. В случае капиллярных колонок неподвижная фаза наносится прямо на их внутренние стенки.
Системой регулировки газов создают необходимый расход газа-носителя.
Разделение смесей веществ методом ГЖХ осуществляется на приборах, называемых газовыми хроматографами .
Газ-носитель из баллона 1 (скорость подачи газа регулируется измерителем 6) через редуктор и манометр поступает в устройство для ввода пробы — испаритель 2. Захватив анализируемую пробу в виде пара или газа, газ-носитель направляется в хроматографическую колонку 3, которая помещена в термостат 7. В колонке анализируемая смесь разделяется на составные компоненты. Выходящие из колонки разделенные компоненты смеси в потоке газа-носителя проходят через детектор 4, который подает слабый электрический сигнал на усилитель, а отсюда — на регистратор (самописец) 5.
Устройства для ввода пробы могут быть разной конструкции в зависимости от агрегатного состояния пробы и способа ее ввода в колонку.
Детектор — устройство, преобразующее в электрический сигнал изменения физических или физико-химических свойств газового потока, выходящего из колонки, по сравнению с чистым газом-носителем.
Существует более 50 видов детекторов, однако широкое применение находят только те из них, которые обладают высокой чувствительностью и универсальностью. Это — катарометр (детектор по теплопроводности); детектор плотности (плотномер); пламенно-ионизационный детектор (ДИП), в котором водородное пламя служит источником ионизации органического соединения; детектор электронного захвата (ЭЗД); термоионный детектор (ТИД), который обладает высокой селективностью к органическим веществам, содержащим фосфор, азот и серу. Интерес к этому детектору заметно возрос в связи с заменой хлорсодер-жащих пестицидов на фосфорсодержащие ядохимикаты.
Катарометр позволяет определять концентрации веществ в пределах 0,1- 0,01%, ДИП -10~3-10~5%, ЭЗД — 10~6-10"10%. Современные детекторы позволяют определять даже пикограммы (10~12 г) веществ.
Обработка результатов хроматографического разделения включает определение качественного и количественного состава анализируемой смеси (см. рис. 17.2).
Определение качественного состава смеси проводится путем сопоставления времени удерживания данного компонента и эталона — вещества известной структуры. При строгом воспроизведении всех условий анализа время удерживания (tR) является такой же физико-химической характеристикой вещества, как его плотность, показатель преломления и т.д. Совпадение времени удерживания эталона и определяемого компонента может указывать на их идентичность. Эталон чаще всего добавляется в исследуемую смесь (метод метки). При этом число пиков на хроматограмме не должно изменяться, а интенсивность пика одного из компонентов должна увеличиваться.
При необходимости сопоставления данных об удерживании исследуемого вещества с литературными (например, при отсутствии необходимого эталона), использование времен удерживания невозможно, т.к. этот параметр сильно зависит от скорости газа-носителя. В этом случае используется удерживаемый объем (VR).
Определение количественного состава смеси основано на допущении того, что интенсивность пика каждого компонента пропорциональна его содержанию в смеси. В качестве меры интенсивности принимается обычно площадь пиков (S). Существуют разные способы измерения площадей пиков. Наиболее простым методом является умножение-высоты пика h (см. рис. 17.2) на его ширину со, измеренную на полувысоте пика:
S = hw
Результаты количественного анализа рассчитывают методами абсолютной калибровки, внутреннего стандарта или простой нормировки. При анализе смеси веществ, близких по химическому строению, хорошие результаты дает метод нормировки. Расчет процентного содержания компонентов по этому методу производится по формуле:
ХХХХХХХ
где xi — искомое процентное содержание г'-того компонента, Si — площадь пика i-того компонента, E, — сумма площадей пиков всех компонентов.
ГЖХ произвела настоящую революцию в исследовании липидов, в особенности, жирных кислот, и до настоящего времени не имеет альтернативы. Первым значимым для биологических исследований анализом, выполненным с помощью ГЖХ, стало определение карбо-новых кислот Джеймсом и Мартином в 1952 году. Это исследование крайне актуально для такой области медицины, как микробиология.
В процессе своего метаболизма микробные клетки производят низшие карбоновые кислоты, причем набор кислот является как бы визитной карточкой того или иного микроорганизма
Газовая хроматография дает возможность количественно оценить весь клинически значимый спектр стероидов. Были разработаны методы определения катехоламинов (адреналина, норадреналина и родственных им соединений), гормонов щитовидной железы, альдо-стерона и кортизола и др.
Метод газовой хроматографии нашел применение при гигиеническом анализе полимерных материалов, состава выхлопных газов, анализа воздуха в производственных помещениях и операционных палатах; хлор-, азот- и фосфорсодержащих пестицидов; определения загрязнений в промышленных сливах (например, содержания фреонов, различных кислот и их производных, ароматических соединений, например, фенола, спиртов, нитрилов и т.д.); для оценки качества пищевых продуктов; для концентрирования и выделения органических загрязнений стоков фармацевтических предприятий.
Технический прогресс сделал возможным получение так называемых метаболических профилей биосред — крови, мочи, слюны, выдыхаемого воздуха. В одном образце анализируются несколько сотен компонентов. Метаболические профили так же индивидуальны, как и отпечатки пальцев, но в отличие от папиллярных узоров хроматограмма метаболитов человеческого организма несет в себе массу медицинской информации — какие лекарства или продукты получал человек в последнее время, каким микроорганизмом вызвано его заболевание и многое другое.
Компьютерный анализ метаболических профилей является одним из мощнейших инструментов диагностики врожденных и приобретенных нарушений метаболизма — таких заболеваний, как сахарный диабет, подагра и многие другие.