Экология и безопасность жизнедеятельности / Saksonov - Ekologicheskiy monitoring neftegazovoy otrasli 2007

довые циклические колебания от влияния антропогенного фактора.

Методы биотестирования, в отличие от биоиндикации, представляют собой характеристику степени воздействия на водные биоценозы. С помощью этих методов можно получить данные о токсичности конкретной пробы воды, загрязненной химическими веществами — антропогенными или природного происхождения. Таким образом, методы биотестирования, будучи биологическими, близки к методам химического анализа вод. В то же время, в отличие от химических методов, они позволяют дать реальную оценку токсических свойств воды или другой среды, обусловленных присутствием комплекса загрязняющих химических веществ и их метаболитов.

Биотесты, как говорилось ранее, не нашли еще пока своего места в отечественной практике, тогда как за рубежом роль биопроб в биологическом мониторинге непрерывно растет. Наиболее широко биотестирование, как метод контроля, применяется в США, где разработаны унифицированные методы оценки токсичности водной среды, которые используются при определении предельно-допустимых уровней загрязнения и разработке критериев качества воды. По данным, приведенным в в работе Руссо (1986), в информационную систему о токсичности сточных вод сложного состава, организованную Агентством по охране окружающей среды (АООС) США введены сведения о токсичности сточных вод или их влиянии на водные объекты по результатам биотестирования, выполненного на 4650 тестах с использованием 145 тест-организмов. В отчете о деятельности только одного регионального подразделения АООС приводятся результаты более 400 ежемесячных тестов на рыбах (определение острой токсичности сточных вод) (Tebo, 1986).

Токсикологические методы оценки качества воды и аппаратура для их реализации разрабатывается и в ряде других стран: Англия, Франция, Германия, Швеция, Швейцария, Чехословакия. Законодательством Германии, регламентирующим отведение сточных вод, предусмотрена их токсикологическая оценка перед выпуском в водные объекты, разработаны переходные коэффициенты между показателем LC50 и безопасным для тест-объекта

81

разбавлением сточных вод. Для целей биотестирования используются в основном тесты на острую токсичность (Peltier, 1986).

Во Франции оценка качества водной среды по токсикологическим показателям является обязательной в «Системе контроля качества пресных вод», созданной на межведомственном уровне. Производственный токсикологический контроль сточных вод проводится более чем на 150 предприятиях с целью выявления наиболее токсичных сточных вод и ограничения попадания их в водные объекты. Для биотестирования применяется стандартный набор биотестов на острую токсичность с использованием бактерий из рода Pseudomonas (ингибирование размножения на 99 % в течение 4 – 8 ч); водорослей из рода Scenedesmus (снижение численности на 50 % за 5 суток); дафний и рыб (гибель 50 % особей за 24 ч) (Vulliermet, 1980).

Наряду с разработкой методов биотестирования в зарубежных странах, есть достижения и в области их стандартизации: в настоящее время в ряде стран (Англии, Австрии, Венгрии, Польше, США, Франции, Финляндии, Швеции и др.) действует более 40 стандартов, в их числе имеются стандарты как общетехнического назначения, так и на конкретные методы (Крайнюкова, 1988).

В работах российских токсикологов неоднократно обсуждались вопросы о значении токсикологического контроля, основанного на биотестировании, для повышения эффективности охраны вод. Этой проблеме посвящены специальные сборники (Патин и др., 1981; Теоретические…,1983). В последние годы накоплен значительный экспериментальный материал, позволяющий судить о действии многих химических соединении и некоторых категорий сточных вод на различные группы организмов. В нашей стране накоплен также и практический опыт испытания или применения биотестов в контроле природных и сточных вод: на Байкальском ЦБК; на ряде предприятий химического, йодобромного, белково-витаминного, нефтеперерабатывающего и других производств; на сбросных и дренажных водах оросительных систем, в ряде лабораторий органов водного надзора.

На основе изучения особенностей реагирования гидробионтов различных экологических и систематических групп на воздействие токсических компонентов промышленных, городских и

82

сельскохозяйственных сточных вод (фенолов, амино-, нитросоединений, тяжелых металлов, нефтепродуктов, СПАВ и др.) в России разработано более 40 методов биотестирования и их модификаций, с использованием различных тест-объектов (Биотестирование…, 1981; Гусев и др., 1970; Лесников, 1970; Строганов, 1971; Apostol, 1973; Maciorowski, 1980; Marking, 1979; Biossay…,1980). В качестве тест-объектов использованы: бакте-

рии – Bacillus cereus, Beneckea harveyi, бактерии активного ила; грибы и актиномицеты—Aspergillus niger, Streptomyces olivaceus; водоросли – Scenedesmus quadricauda, Sc.acuminatus, Chlorella vulgaris, Euglena gracilis, Dunaliella salina, Nitella flexilis, Phaeodactilum tricornutum, Cladophora fracta; простейшие – Tetrahymena pyriformis, Spirostomun ambiguum, Euplotes sp.; беспозвоночные – Daphnia magna, Hydra attenuata, Hirudo medicinalis, Unio tumidus, Eulimnogammarus verucosus, Myzuchopecten yessoensis; рыбы – Perca fluviatilis, Phoxinus, phoxinus, Cyprinus carpio, а также фер-

ментные препараты.

В методах биотестирования с использованием бактерий регистрируются интенсивность размножения клеток, биолюминесценции, активность окислительных ферментов бактерий активного ила. В биотесте с использованием плесневых грибов и актиномицетов регистрируется ростовая реакция тест-объектов. В биотестах на водорослях используются различные реакции: интенсивность размножения клеток, уровень медленной флуоресценции, иммобилизация клеток и зооспор, биоэлектрическая реакция, плазмолиз, фотосинтетическая активность клеток, способность клеток к дифференцированному окрашиванию. В методах с использованием простейших регистрируются интенсивность размножения, двигательная активность и морфологические изменения. В биотестах на дафниях учитываются выживаемость, плодовитость, сукцинатдегидрогеназная активность, интенсивность дыхания и сердцебиения. В методах с использованием других беспозвоночных фиксируется регенерация подошвы гидры, изменение поведения медицинской пиявки, перловицы, приморского гребешка, гаммарид. У рыб в качестве тест-функций используются поведенческие реакции, двигательная активность, интенсивность сердцебиения и дыхания, способность к изменению пигментации кожных покровов.

83

Основной принцип биологического тестирования сводится к оценке достоверных различий между опытом (среда, содержащая токсикант) и контролем (чистая вода) по какому-либо показательному параметру тестируемого объекта, указывающему на полное или частичное угнетение жизненных функций тест-орга- низмов под влиянием испытуемой воды или индивидуальных токсикантов в определенных концентрациях (Брагинский, 1979; Патин, 1981; Крайнюкова, 1988).

При выборе тест-объектов предпочтение отдается видам и штаммам, которые широко распространены в природе и легко культивируются в лабораторных условиях. Различают два типа тест-объектов: индикаторные и представительные. К первым принадлежат организмы с наибольшей степенью чувствительности к токсикантам различных классов, ко вторым – организмы, наиболее полно представляющие определенный гидробиоценоз. Так, например, к индикаторным тест-организмам относятся Daphnia magna Straus, причем метод биотестирования с использованием этого рачка рекомедован в качестве первоочередного для контроля сточных вод в установившемся режиме и выявления потенциально опасных источников загрязнения водных объектов токсическими веществами. А в качестве представительного тест-объекта для байкальского зоопланктона, можно считать Epischura baikalensis Sars, так как достигая в отдельные периоды 80-90 % общей биомассы зоопланктона этот рачокфильтратор играет важнейшую роль в трофических взаимоотношениях байкальских организмов и в процессах поддержания повышенной чистоты байкальской воды.

Поскольку во многих случаях животные организмы обладают большей чувствительностью в распознавании токсического вещества, чем самые точные аналитические методики, то это свойство представляет особый интерес в вопросах их использования для оценки эколого-токсикологической ситуации в водоеме. Однако, однозначного ответа, токсично ли вещество и насколько токсично, бывает мало. Поэтому очень важно обратить внимание на представительные организмы, которые по своим физиологическим и биологическим свойствам представляют ту группу организмов, которая в большей степени характерна для

84

данного водоема (Стом и др., 1993) и играют в нем определяющую роль.

Для биотестирования используются в основном тесты на острую токсичность, причем применяется стандартный набор, включающий бактерии, водоросли, дафнии, моллюски, высшие водные растения и рыбы (Жмур, 1997). Особенно перспективным представляется метод биотестирования, основанный на гашении люминесценции светящихся бактерий, получивший широкое распространение как у нас в стране, так и за рубежом (Гиль и др., 1993; Kratasyuk, 1990; Гриценко, 1997; Данилов, 1983). Отклик люминесцентных бактерий на токсические вещества тесно коррелирует с таковым у других биологических организмов и величина 50%-го тушения свечения – ЕС50 хорошо соотносится с летальной концентрацией для высших животных и человека, а также с другими биосенсорами (Михайлова, 1998).

Оперативная интегральная оценка качества воды и почвы методами биотестирования, описанными выше, не заменяет количественный химический анализ, но она его дополняет и, в ка- кой-то степени, может предварять, благодаря экспрессности, простоте и невысокой стоимости методов биотестирования.

Описанные выше методы биотестирования, разработанные на примере сточных вод и отдельных химических соединений апробированы для анализа токсичности водных вытяжек почв и отходов, загрязненных различными веществами, в том числе нефтепродуктами.

Контрольные вопросы

1.В чем заключаются недостатки оценки загрязнения природных сред, основанной только на измерении концентраций химических веществ?

2.Почему оценка токсичности воды методами биотестирования считается интегральной?

3.Какие тест-реакции используются в биотестировании природных и сточных вод?

4.Отличие методов биоиндикации от методов биотестиро-

вания?

5.Понятие об индикаторных и представительных тестобъектах?

85

5 МЕТОДЫ БИОТЕСТИРОВАНИЯ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ДЛЯ ЦЕЛЕЙ ПРОИЗВОДСТВЕННОГО ЭКОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА

5.1 Биоиндикационные методы и методы биотестирования атмосферного воздуха

Сильнейшее антропогенное воздействие на фитоценозы оказывают загрязняющие вещества в окружающем воздухе такие как диоксид серы, оксиды азота, углеводороды. Устойчивость растений к загрязнителям различна. Было установлено, что на лишайники губительно действуют прежде всего вещества, увеличивающие кислотность среды, ускоряющие окислительные процессы, т.е. такие соединения как SO2, HF, HCl, оксиды азота, озон (Turk, 1988). Суждение о загрязнении атмосферного воздуха базируется на сравнительном изучении видового состава лишайников, распространении отдельных видов, морфологических изменений слоевищ, физиологических показателей, прироста и др. (Бязров, 1991).

Для условий лесной полосы России наиболее чувствительны хвойные деревья (пихта, сосна, кедр). Информативными по техногенному загрязнению являются морфологические и анатомические изменения, а также продолжительность жизни хвои.

Современные биоиндикационные исследования сконцентрированы на методах раннего распознования, показывающих изменения в метаболизме, которые предшествуют видимым симптомам повреждения. Ранние способы определения повреждений возможны на первичных уровнях воздействия, т.е. в системе хлоропластов ассимилирующих органов (Шульц, 1991).

Перед видимым повреждением биохимические и физиологические параметры хлоропластов показывают определенные изменения, зависящие от концентрации загрязнителей. Когда эти индикационные параметры достигают определенного значения, то, например, хлорозы и некрозы могут ожидаться на следующем более высоком индикационном уровне.

Желательно использовать аппаратурные и экспрессные методы мониторинга с тем, чтобы обеспечивать возможность объективной оценки состояния большого числа растений за короткое

86

время. В этом отношении перспективно применение биофизических методов, в первую очередь флуоресцентных. Для оценки качества воздушной среды может быть использовано гашение флуоресценции хлорофилла растительных клеток. Этот способ был реализован и для дистанционного зондирования. Более распространен и успешно апробирован метод биоиндикации воздушной среды на основе замедленной флуоресценции хлорофилла (Григорьев и др., 1999; Венедиктов и др., 2000).

Замедленная флуоресценция генерируется в ходе обратных реакций рекомбинации первичных продуктов фотосинтеза и ее характеристика несет информацию о функционировании реакций фотосинтеза. Загрязняющие вещества, угнетающие фотосинтез, вызывают ингибирование замедленной флуоресценции.

Следует отметить, что нормативные документы по методам биологического контроля загрязнения атмосферного воздуха в нефтегазовой отрасли отсутствуют и биоиндикационный контроль должны осуществлять высококвалификационные специа- листы-экологи.

5.2Методы биотестирования и биоиндикации в контроле загрязнения водной среды

5.2.1Классность природных вод по системе биоиндикации

Установлено, что истинную оценку воздействия на водную среду невозможно дать по изолированному действию отдельных веществ.

Не дают адекватной оценки состояния водных экосистем и методы биотестирования – экспериментального определения токсичности воды для обитателей водоемов, основанного на регистрации реакций тест-объектов, поскольку возможность экстраполяции результатов, полученных биотестированием in situ, на естественные водоемы крайне ограничена. При разработке и стандартизации методик биотестирования практически невозможно учесть все существующие особенности жизнедеятельности организмов.

Критерий классности вод устанавливает уровень загрязнения по биоиндикаторному методу прямой оценки качества воды

87

(Временные…,1993). Метод биоиндикации вод, применяемый в мировой практике, является наиболее оперативным и информативным, носит интегральный характер и широко используется при индикации качества вод малых рек России. Метод учитывает наличие и условную значимость индикаторных таксонов в водоемах, разнообразие сообществ микроорганизмов, дает взвешенную оценку классности вод.

Градация качества вод осуществляется по шести классам в соответствии с мировой практикой биоиндикации вод. Так, первому классу соответствует очень чистая вода, шестому – очень грязная.

Уровень загрязнения вод оценивается по результатам гидробиологических анализов с ранжированием на 6 классов в соответствии с общепринятой классификацией (Временные…, 1993).

Определение классности вод осуществляется путем идентификации присутствующих в водоеме биотаксонов с помощью Атласа, содержащего изображения микроорганизмов, отдельные подробности строения и их краткое описание (Атлас…, 1984).

5.2.2 Биотестирование вод

В результате процедуры лабораторного биотестирования при использовании классических методов устанавливается острая или хроническая токсичность исследуемой воды в экспериментах различной продолжительности.

Острый опыт — краткосрочная процедура биотестирования (с установленным в каждой методике временем экспозиции), определяющая острую токсичность исследуемой воды по 50%-ной выживаемости (смертности) тест-объектов. Острая токсичность выражена в том случае, если интенсивность воздействующего агента велика настолько, что компенсаторная и адаптационная реакция организма не успевают проявиться, и он гибнет.

Хроническая токсичность определяется при менее интенсивном, но более длительном воздействии токсикантов; при этом происходит нарушение равновесия между распадом и синтезом веществ в организме гидробионтов, разрушение генома и прекращение воспроизводства.

88

На основании данных проведенных экспериментов устанавливается остро летальная концентрация вещества (или кратность разбавления исследуемой воды), при которой наступает 50%-ная гибель тест-организмов и безвредная (недействующая) концентрация вещества, или безвредная кратность разбавления исследуемой воды, при которой гибель организмов не превышает таковую в контроле. Данные о хронической токсичности получают в длительном эксперименте, в котором также может устанавливаться безвредное разбавление.

Безвредное разбавление, как показатель токсичности, принято для количественной оценки степени вредности исследуемых вод, поскольку отвечает на вопрос о том, во сколько раз требуется разбавить исследуемую воду водой удовлетворительного качества (безвредной) для ликвидации в ней токсичности

При использовании разных методов биотестирования для оценки токсичности вод, в которых приняты различные тестреакции, эффекты токсичности и способы оценки результатов (дафнии, бактерии, инфузории), показатель безвредного разбавления чрезвычайно важен, так как позволяет легко сопоставить полученные результаты.

Чтобы дать правильную оценку полученным результатам, следует тщательно проанализировать химический состав сточных вод. Кроме того, если в используемой методике биотестирования не оговаривается эффект стимуляции и его допустимая норма, то необходимо применить для такой воды несколько методов биотестирования и использовать для выводов результаты, полученные на других организмах. Если же в методике оговаривается возможность стимуляции и указана норма отклонения, принятая за токсичность, то следует руководствоваться установленными нормами.

Отбор проб, процедуру биотестирования, выбор тесторганизмов, а также обработку и оценку результатов проводят в соответствии с требованиями РД 118-02-90. Контролю подвергаются сточные воды на выпуске в водный объект: канализуемые, из замыкающего створа с площади водосбора территории промысла, ливневоталые воды, а также водные объекты (ручьи, речки, болота) – приемники сточных вод и грунтовые воды на территории предприятий и за его пределами.

89

В настоящее время для анализа загрязнения чаще всего применяется классический дафниевый тест, в котором критерием служит выживаемость (Степанови др., 1999), а также другие функциональные характеристики. Это может быть и изменение фототаксической реакции (Michel et al., 1999) и образование свободных радикалов в микросомной фракции, которые обнаруживаются in vitro спектрофотометрическим либо флуориметриче-

ским методом (Sanderson et al., 1999).

Другой более простой способ описан Bailleiul Mars и Blust Ronny (1999).

Они предлагают при токсикометрии каких-либо веществ в течение суток измерять размеры дафний и скорость их передвижения. Используется автоматизированный метод определения активности β -галактозидазы у взрослых Daphnia magna, описано его преимущество с классическим тестом по иммобилизации

(Weltens et al., 2000).

Культура дафний наиболее удобна и при изучении влияния лучевого и химического патогенеза, при котором наблюдая за уровнем свободных радикалов, оценивают стресс биотеста по его реакции на токсичность среды, причем этим методом показано, что ПДК для рыбохозяйственных водоемов занижены, что может привести к снижению в них биоразнообразия (Мелехова, 1999). Репродуктивность и газообмен оценивала в токсикологических опытах с дафниями Е.А.Сапрыкина (1998).

При осуществлении государственного экотоксикологического контроля допускается использование тех методик биотестирования, которые внесены или планируются к внесению в Госреестр (таблица 5.2.1).

90