8.15. Хроматографический анализ: классификация, назначение. Тонкослойная хроматография: принципы, назначение.

Хроматографический метод разделения веществ, впервые осу­ществленный М.С. Цветом (1903), является одним из наиболее избирательных методов разделения близких по химической структуре веществ.

Хроматографическим разделением обычно называют про­цесс, при котором компоненты разделяемой смеси многократно распределяются между двумя несмешивающимися фазами: не­подвижной (стационарной) и подвижной (мобильной). Разделе­ние веществ происходит либо за счет их способности связываться с поверхностью сорбентов, либо за счет распределения между не­подвижной фазой, которая может быть твердой или жидкой, и подвижной фазой — жидкой или газовой, либо за счет способ­ности вещества образовывать гетерополярные связи с сорбента­ми, которые содержат ионы с зарядом, противоположным по зна­ку заряду иона анализируемого вещества.

Различные виды хроматографии классифицируются на осно­ве природы атомно-молекулярного взаимодействия разделяемых веществ с той либо иной фазой.

Выделяют адсорбционную, ионообменную, распределитель­ную, гельхроматографию, аффинную хроматографию (нашед­шую применение в иммуноферментных методах) и некоторые другие.

В зависимости от физического состояния применяемых фаз различают следующие типы хроматографического анализа.

Классификация типов хроматографического анализа.

Подвижная фаза	Неподвижная фаза	Тип метода	Вид метода
Газ	Жидкость	Газовая хроматография	Газожидкостная хроматография Газоадсорбционная хроматография
	Твёрдое вещество
Жидкость	Жидкость	Жидкостная хроматография	Жидкостно-жидкостная хроматография Жидкостно-адсорбционная хроматография
	Твёрдое вещество

Получивший в последнее время широкое распространение (особенно для фракционирования липидов) метод хроматогра­фии в тонких слоях нельзя полностью отнести ни к одному из описанных способов разделения. Этот метод включает в себя эле­менты как распределительной, так и адсорбционной хромато­графии.

В адсорбционной хроматографии разделение веществ основано на их различной сорбируемости на поверхности твердой фазы. Как правило, при этом адсорбируемость растворителя должна быть значительно меньше таковой анализируемой смеси. Это обеспечивает наиболее полное использование разделяющей спо­собности адсорбента.

Процесс адсорбции зависит от свойств адсорбентов, адсорби­руемых соединений и от растворителей: он может иметь химиче­ский или физический характер (иногда трудно провести границу между этими видами адсорбции). Физическая адсорбция опреде­ляется многими физико-химическими факторами, связанными прежде всего с емкостью и типом сорбента; химическая адсор­бция вызывается образованием лабильной химической связи между адсорбентом и хроматографируемым веществом.

Метод ионообменной хроматографии представляет собой ана­литический метод определения ионов, основанный на способ­ности некоторых твердых веществ (ионообменников) обменивать ионы при контакте с растворами электролитов. В качестве ионообменников (ионитов) используются нерастворимые высокомо­лекулярные вещества природного или синтетического происхож­дения, а также неорганические ионообменники. Они бывают двух типов: анионообменники (аниониты) и катионообменники (катиониты). Ионообменная хроматография используется для разделения органических и неорганических соединений, способ­ных к диссоциации.

Ионообменная хроматография используется в аминокислот­ных анализаторах для определения отдельных аминокислот.

При распределительной хроматографии разделение происхо­дит вследствие различной растворимости (распределения) рас­творяемых веществ в двух несмешивающихся фазах. Для осущес­твления ее необходима система, состоящая из неподвижной фазы (носителя) и подвижной фазы (растворителя). На неподвижную фазу наносится смесь веществ, и через нее пропускается ток рас­творителя. Чем лучше данное вещество растворимо в подвижной фазе, тем дальше оно продвинется по направлению тока раство­рителя по неподвижной фазе. Менее растворимые вещества рас­пределяются ближе к точке нанесения (соответственно своей растворимости).

Различают следующие виды распределительной хроматографии:

1) колоночную;

2) бумажную (лист бумаги рассматривают как сплюснутую ко­лонку, где действуют законы и распределения, и адсорбции, и ионообмена);

3) тонкослойную — на тонком слое адсорбента: силикагеля, окиси алюминия, ионообменной смолы;

4) газовую, газожидкостную (подвижной фазой служит газ, и изучаемое вещество переводится в газообразную форму).

Химическая хроматография. При ней распределение происхо­дит в результате установления прочной связи между разделяемым веществом и неподвижной фазой (комлексообразование, оса­дочная хроматография). Осадочная хроматография характеризу­ется многократным повторением процесса образования и раство­рения осадка, происходящего на поверхности высокодисперсно­го вещества.

Аффинная хроматография: биоспецифическая хроматогра­фия — находит применение в современных методах клинической химии.

Разделение компонентов анализируемой смеси методом газо­вой хроматографии основано на их многократном распределении между двумя различными фазами. Неподвижной фазой служит твердое вещество или жидкость, а подвижной всегда является газ. Если неподвижная фаза — твердое вещество (тип хроматографии «газ — твердое вещество»), разделение компонентов смеси про­исходит за счет их различной способности связываться с адсор­бентом. Если неподвижной фазой служит нелетучая жидкость (тип хроматографии «газ — жидкость»), компоненты анализиру­емой смеси разделяются за счет их различной растворимости в неподвижной фазе.

Метод газовой хроматографии пригоден для анализа газов и других веществ, которые могут быть переведены в газообразное состояние без разложения (примером может служить образова­ние летучих соединений метиловых эфиров жирных кислот).

Газовая хроматография является удобным методом разделе­ния газов и смесей летучих веществ, молекулярная масса которых не превышает 300 Д.

Высокоэффективная жидкостная хроматография высокого дав­ления (ВЭЖХ) — метод разделения веществ с использованием жидкости в качестве подвижной фазы. Разделение обусловлено тем, что одни компоненты разделяемой смеси сорбируются не­подвижной фазой лучше, чем другие. Если компоненты разделя­емой смеси лучше растворимы (сорбируются) в неподвижной фазе, то они перемещаются медленнее; если же их растворимость выше в подвижной фазе, они движутся быстрее.

Хроматографическое разделение является следствием разной скорости движения веществ по колонке и различий в скорости установления равновесия. ВЭЖХ под давлением осуществляется только в колоночном варианте (применяются узкие колонки ди­аметром 1—3 мм, размер частиц пористого носителя не более 50 мкм, скорость протекания растворителя по колонке — около 5 мл/мин).

Для повышения чувствительности метода предпочитают ис­пользовать флюориметрический детектор ВЭЖХ (анализатор «Флюорат-02-2М» и др.).

Жидкостная хроматография под давлением применяется для разделения смеси веществ с высокими температурами кипения. Этот метод используется для анализа веществ с большой молеку­лярной массой — 1000—2000 Д и более.

Научно-производственным предприятием «Экотехника», НПФ «Люмэкс» разработаны аппаратура и методы высокоэф­фективной жидкостной хроматографии применительно к ис­пользованию в области медицины. Они применяются для биохи­мической диагностики в кардиологии, неврологии, онкологии, гастроэнтерологии, наркологии, токсикологии, судебной меди­цине — с целью определения содержания в биологических жид­костях и тканях: катехоламинов и их метаболитов (в том числе ванилил-миндальной и гомованилиновой кислоты), серотонина и его конечного продукта разрушения — 5-гидроксииндолуксусной кислоты, гистамина, простагландинов, нефропептидов, стероидов, аминокислот, полиаминов, моно- и дисахаридов, нуклеотидов, нуклеозидов, нуклеиновых кислот, спиртов, кетонов, гликолей, галогеноводородов, опиатов, белков, триацилглицеринов, ряда чужеродных соединений (барбитуратов, гербицидов и др.), активности ферментов.

Фирмой «Биосистемс» поставляются очень удобные в приме­нении «киты» (наборы реагентов с расходными материалами для определения катехоламинов, их метаболитов и других биологи­чески важных веществ методом микроколоночной хроматографии).

В последние годы в клинико-лабораторной практике все шире применяются методы тонкослойной хроматографии (ТСХ) на си-ликагеле. Разделение веществ при их использовании основывает­ся на принципах адсорбционной и распределительной хромато­графии. С этой целью более удобно применять готовые к упот­реблению пластинки, поставляемые фирмами «Хемапол», «Мерк» и др. Находит употребление и выпускавшийся в СССР «Комплект оборудования для тонкослойной хроматографии КТХ-01».

При хроматографии в тонком слое применяют два основных типа пластинок: с закрепленным и незакрепленным (насыпным) слоями.

Пластинки с закрепленным слоем готовят, заливая суспензи­ей мелко размолотого хроматографического материала в воде или органическом растворителе, к которой добавляют связующее ве­щество для закрепления слоя (например, крахмал). В некоторых случаях, когда присутствие связующего звена отрицательно ска­зывается на результатах анализа, его не добавляют в суспензию.

Пластинки с незакрепленным слоем готовят из одного сор­бента, разравнивая его по стеклянной пластинке до получения слоя одинаковой толщины.

Пластинки с закрепленным (крахмалом) слоем силикагеля «Silufol» широко применяются для фракционирования липидов биологических жидкостей, гомогенатов тканей, других биосуб­стратов.

Хроматографические пластинки «Silufol» перед применением рекомендуется активировать нагреванием в сушильном шкафу в течение 30 мин при температуре 100—110°С, но их можно применять и без активирования. В процессе активирования из слоя си­ликагеля удаляются пары воды, но они быстро проникают снова в сорбент, если активированные пластины не помещаются в эк­сикатор с серной кислотой (эквилибрация с окружающей средой наступает уже в первые минуты).

Перед хроматографией пластинки рекомендуется промыть (путем восхождения по ним фронта растворителей) с целью уда­ления примесей, случайно попавших в силикагель. После про­мывки пластинку сушат в токе теплого воздуха или в сушильном шкафу при 100— 110°С в течение 30 мин.

Нанесение вещества производится с помощью капилляров или тонко градуированных пипеток. Линии или точки нанесения диаметром примерно в 3 мм должны быть на расстоя­нии 1,5—2,0 см от нижнего края пластинки — для того чтобы они не были погружены в разделяющую смесь.

В абсолютном большинстве случаев хроматографирования используется метод восходящего разделения в прямоугольных камерах шириной 90 мм, высотой и длиной 220 мм или другие, в том числе импровизированные. В камеру наливается разделяю­щая смесь до высоты примерно 1 см и закрывается односторонне пришлифованной крышкой для того, чтобы не происходила утеч­ка паров растворителя. Пластинку в камере выдерживают до тех пор, пока фронт растворителя не достигнет верхнего края пласти­ны. Разделительный путь — расстояние от места с нанесенными образцами (старт) до фронта растворителя — обычно равен 10 см. Если однократного восхождения растворителей недостаточно для фракционирования анализируемой смеси на компоненты, при­меняют ступенчатый метод разделения с применением двух, а иногда и большего количества разделяющих смесей друг за другом.

Смесь растворителей включает в себя полярную и неполяр­ную жидкости. Полярный растворитель связывается с силикагелем и медленно перемещается по его поверхности, неполярный растворитель слабо связывается с силикагелем и как бы скользит по полярному растворителю. Вещества, хорошо растворимые в неполярной фазе («подобное растворяется в подобном»), переме­щаются к верхнему краю пластины быстрее, чем полярные ком­поненты анализируемой смеси. На скорость перемещения ве­ществ влияет и эффект различной сорбции их адсорбентом (силикагелем).

При подборе пригодного растворителя принимается во вни­мание то, что полярный растворитель сообщает веществу мень­шую скорость перемещения, неполярный — большую. Раствори­тели располагаются в следующем ряду — от неполярного к поляр­ному: гексан, бензол, хлороформ, диэтиловый эфир, этилацетат, ацетон, бутанол, пропанол, этанол, метанол, вода.

Обычно применяются смеси из двух и более составных частей, когда к неполярному растворителю добавляется определенное количество полярных составных частей либо еще кислота (уксус­ная, муравьиная) или аммиак.

После окончания хроматографии пластинку вынимают из ка­меры, сушат в горизонтальном положении до полного испарения остатков растворителя.

Важным фактором, влияющим на процесс разделения, явля­ется степень насыщения хроматографических камер парами раз­деляющей смеси. Для хроматографии в насыщенной камере на­сыщение проводят следующим образом. Обе боковые и задняя стенки камеры обкладываются целой полоской фильтровальной бумаги, которая касается растворителя на дне камеры и пропиты­вается им. После этого атмосфера в закрытой камере насыщается в течение 2 ч. Только по истечении указанного периода на корот­кое время открывается крышка и быстро вставляется в камеру хроматографическая пластинка.

Универсальным методом обнаружения разделенных компо­нентов является просмотр хроматограмм при облучении корот­коволновым (254 нм) — «Silufol UV-254» — или длинноволновым (366 нм) — «Silufol UV-366» — светом. Для этого в адсорбент вно­сится специальное флюоресцирующее вещество, проникающее в макроструктуру сорбента: в месте расположения пятна прикры­ваемая им зона пластины не светится. Это позволяет обвести тон­кой иглой соответствующую фракцию для того, чтобы в дальней­шем произвести аналитическое исследование.

Крахмал, применяемый в качестве связующего звена, в от­дельных случаях мешает определению компонентов анализируе­мой смеси. Это касается прежде всего метода обнаружения йодом либо серной кислотой.

В случае определения фракций липидов пластины обычно об­рабатываются раствором фосфорномолибденовой кислоты, раз­брызгиваемым с помощью пульверизатора. Пятна проявляются уже при комнатной температуре и становятся более интенсивны­ми при температуре 70—80°С (в течение 3 мин выдерживания).

В дальнейшем производят количественный учет результатов методом денситометрии. [6, 9, 15]

8.16. Фотоэлектроколориметрия: принцип метода, принципиальная схема, назначение. Техника построения калибровочных графиков и использование стандартных растворов для определения концентрации исследуемых веществ в опытных растворах.