МЗ РФ ВГМУ 2 высшее образование

«Молекулярно – генетические методы изучения генетики человека

Проф Каредина В.С.

Методы изучения генетики человека

Клинико – генеалогическийБлизнецовый

Популяционно – статистическийЦитогенетический

Метод генетики соматических клетокБиохимический методМолекулярно – генетическиеМетод приемных детейАнтропометрическийДерматоглифика

Молекулярно – генетические методы.

Конечный итог молекулярно- генетических методов — выявление изменений в определенных участках ДНК, гена или хромосомы. В их основе лежат современные методики работы с ДНК или РНК. В 70-80 гг. в связи с прогрессом в молекулярной генетике и успехами в изучении генома человека молекулярно-генетический подход нашел широкое применение.

.

Начальным этапом молекулярно-гене-

тического анализа является получение образцов ДНК или РНК. Для этого используют геномную ДНК (вся ДНК клетки) или отдельные ее фрагменты. В последнем случае, чтобы получить достаточное количество таких фрагментов, необходимо, амплифицировать (размножить) их.

Для этого пользуются полимеразной цепной реакцией — быстрым методом ферментативной репликации определенного фрагмента ДНК. С его помощью можно амплифицировать любой участок ДНК, расположенный между двумя известными последовательностями.

Анализировать огромные молекулы ДНК в том виде, в котором они существуют в клетке, невозможно. Поэтому прежде их необходимо разделить на части, обработать разнообразными рестриктазами — бактериальными эндонуклеазами. Эти ферменты способны разрезать двойную спираль ДНК, причем места разрыва строго специфичны для данного образца. Расщепление ДНК рестриктазами дает характерный набор фрагментов (4-6 пар оснований), отличающихся по длине.

Фракционирование (т.е. разделение)

фрагментов ДНК по размеру и длине проводится с помощью электрофореза на поверхности агарозного или полиакриламид-ного геля. Под действием электрического поля фрагменты ДНК начинают перемещаться вниз по гелю со скоростью, зависящей от их длины. (Чем короче фрагменты, тем быстрее они движутся). В результате каждый фрагмент ДНК занимает определенное положение в виде дискретной полосы в конкретном месте геля.

Длину каждого фрагмента можно определить

путем сравнения расстояния, пройденного им и стандартным (с известными размерами) отрезком ДНК.

Молекулярно -.генетическую диагностику наследственных болезней используют и для изучения генома человека. Чтобы выявить необходимые для этого специфические фрагменты ДНК, используют блот-гибридизацию по Саузерну. Сущность этой методики кратко состоит в следующем: сначала осуществляют денатурацию ДНК с образованием одноцепочечных фрагментов, которые переносят на нитроцеллюлезный или нейлоновый

фильтр в буферном растворе.

Молекулярно - генетическую

диагностику наследственных болезней используют и для изучения генома человека. Чтобы выявить необходимые для этого специфические фрагменты ДНК, используют блот-гибридизацию

по Саузерну.

Сущность этой методики кратко состоит в следующем: сначала осуществляют денатурацию ДНК с образованием одноцепочечных фрагментов, которые переносят на нитроцеллюлезный или нейлоновый фильтр в буферном растворе.

Агарозный гель с фрагментами ДНК

помещают на фильтровальную бумагу, смоченную концентрированным

солевым раствором. На гель накладывают нитроцеллюлезный фильтр, а сверху помещают сухую фильтровальную бумагу, в которую впитывается солевой раствор. ДНК переносится вместе с раствором, но задерживается фильтром и практически полностью оказывается на его поверхности. Затем одноцепочечные ДНК фиксируют на фильтре. Расположение фрагментов на фильтре точно соответствует их расположению в геле.

Чтобы выявить нужные фрагменты,

проводят гибридизацию ДНК с радиактивным ДНК-зондом или клонированным фрагментом ДНК. Нуклеотидная последовательность зонда должна быть полностью или частично комплементарна изучаемому участку геном ной ДНК.

Результат гибридизации комплементарных цепей радиоактивного ДНК-зонда и фрагмента ДНК обнаруживают с помощью радиоавтографии: каждая комплементарная зонду последовательность ДНК проявляется в виде радиоактивной полосы.