Курс л. Выд. пр. биотех. Новиков Д

полной солюбилизации всех компонентов, тогда как нужный объект экстрагируется полностью.

Часто экстракт получается мутным. После центрифугирования на его поверхности могут плавать частицы жира. Жир можно удалить грубой фильтрацией через стекловату или плотную фильтровальную ткань. Нерастворимые частицы суспензии содержат органеллы и фрагменты мембран, которые полностью осаждаются только при 100 000 g - процедура очень неудобная для больших объемов экстракта. Фильтрация в таких случаях обычно бесполезна, так как если фильтр достаточно плотен и задерживает частицы, то он быстро засоряется. Однако, если мутность незначительна, но нужен прозрачный экстракт - на пример для пропускания через адсорбционную колонку, фильтрацию можно провести с помощью целита.

Различные типы экстрактов. При работе с некоторыми животными тканями частицы составляют незначительную часть экстракта и ими можно пренебречь. Они агрегируют при первом же фракционировании сульфатом аммония и затем удаляются. С другой стороны, есть животные ткани, содержащие больше жиров и мембранных структур; при экстрагировании таких тканей образуются суспензии. Подкисление среды до рН 6,0-5,0 обычно приводит к агрегации материала, который можно затем отцентрифугировать при относительно низкой скорости. Рибосомы и другие нуклеопротеиды обычно удаляются при подкислении, которое можно рассматривать как одну из форм изоэлектрического осаждения (разд. 3.2); фосфатные группы протонируются и нейтрализуют или по край ней мере снижают заряд частиц суспензии. Этот способ дает очень хорошие результаты при условии, что нужный белок а) не осаждается изоэлектрически при данном значении рН, б) не адсорбируется на образовавшемся осадке или в) остается стабильным, при нефизиологических значениях рН. Экстракт охлаждают и снижают рН соответствующей кислотой (например, 1 М уксусной). После перемешивания в течение 10-20 мин осадок отделяют центрифугированием, а рН надосадочной жидкости доводят, если необходимо, до нужного значения перед тем, как приступить к первому этапу фракционирования. Растительные ткани отличаются, прежде всего, тем, что реакция среды в них более кислая и содержащиеся в них частицы, такие, как фрагменты хлоропластов, агрегируют значительно труднее. К тому же растительные экстракты содержат сравнительно мало корпускулярного материала, если не считать грубых частиц типа зерен крахмала, которые легко осаждаются после приготовления экстракта.

При приготовлении экстрактов из микроорганизмов возникает целый ряд проблем. Во-первых, из быстропролиферирующих клеток экстрагируется много нуклеиновых кислот. Во-вторых, в процессе разрушения клеток материал клеточной стенки либо сильно диспергируется, в результате чего раствор становится мутным, либо частично растворяется, так что в растворе наряду с белками и нуклеиновыми кислотами оказывается много

31

камедеподобных полисахаридов. Это создает определенные трудности на первых этапах фракционирования.

Экстракты, приготовленные из бактериального материала при помощи пресса Френча, под воздействием ультразвука или при обработке лизоцимом, получаются вязкими из-за присутствия в них ДНК и содержат значительные количества рибосомного материала. Все нуклеиновые кислоты осаждаются в результате их агрегации с макромолекулярными поликатионами. Хорошими реагентами для этого служат протамин лососевых рыб и клупеин молок сельди, поскольку связывание с ДНК - естественная функция этих веществ. С обычно используемым протаминсульфатом следует быть весьма осторожным: он обладает сильными кислотными свойствами, и перед употреблением его необходимо растворить в воде и нейтрализовать. Следует установить, какое количество протаминсульфата потребуется; оно может достигать 5 мг на 1 г обрабатываемого материала. Протаминсульфат осаждает ДНК, рибосомные нуклеиновые кислоты, мРНК, тРНК и другие нуклеиновые кислоты. На образовавшемся осадке могут также адсорбироваться некоторые белки. Адсорбцию на протаминовом осадке используют даже как этап в процессе очистки ферментов. Если применение протамина окажется невозможным или нежелательным, вязкость раствора ДНК можно снизить, используя при получении экстракта ДНКазу. Рибосомы можно осаждать стрептомицином. Хотя стрептомицин хуже осаждает нуклеиновые кислоты, чем протамин, при его использовании теряется меньше белка в результате адсорбции на образующемся осадке.

После удаления нуклеиновых кислот в растворе могут остаться капсульные камедеподобные углеводы. Это создает трудности при использовании обычных методов осаждения белков. В присутствии этих веществ невозможно применение сульфата аммония и других методов фракционного осаждения. Лучше полностью осадить белок в надежде, что камедеподобные вещества останутся в растворе. Практически весь белок можно осадить при 80%-ном насыщении сульфатом аммония или 55%-ной концентрации ацетона. В случае использования сульфата аммония для осаждения белка может понадобиться скоростное центрифугирование. Но даже после этого растворенный белковый осадок содержит вещества, снижающие воспроизводимость результатов при работе на колонке или при использовании других методов фракционирования. Недавно найдены два пути преодоления этих трудностей. Первый путь - это «амфифильная» адсорбция на геле агарозы, при которой все белки адсорбируются на гранулах агарозы в растворе сульфата аммония 70-80% -ного насыщения, тогда как небелковый материал вымывается. При экстракции гранул агарозы буфером белок переходит в раствор, который далее фракционируют обычным способом. Второй путь - использование соответствующего метода экстракции. При обработке клеток лизоцимом обычно не образуется слишком много капсульных камедеподобных веществ - лизоцим растворяет их, но не разрушает все бактериальные клетки. Для получения достаточно

32

прозрачного экстракта из бактерий успешным оказалось использование лизоцима вместе с неионным детергентом. После удаления нуклеиновых кислот такой экстракт можно непосредственно использовать для фракционирования. Подобные проблемы возникают при работе не со всеми бактериями. Опубликовано множество работ по выделению ферментов из бактериального материала, в которых успешно проводится обычное фракционирование вслед за обработкой экстракта протамином или стрептомицином.

Приготовление экстрактов из дрожжей связано с несколькими проблемами. Главная из них состоит в том, что клеточные стенки у грибов очень толстые и их трудно разрушить. Поэтому для получения экстракта требуются более эффективные методы. Если экстракт нужно получить быстро, единственный надежный способ - это применение вибрационной шаровой мельницы или гомогенизатора Мэнтона - Гаулина. При использовании этих методов образуется большое количество частиц низкой плотности, которые не полностью удаляются центрифугированием. Мутность может снизить эффективность осаждения белка сульфатом аммония. Однако ее можно устранить путем агрегации частиц в органическом растворителе (ацетон, 20-25% по объему при 0°С). В прозрачном растворе остается большинство ферментов, которые осаждаются при повышении концентрации ацетона. Прозрачные экстракты получают также, используя автолиз толуолом, но в этих условиях может происходить протеолитическое расщепление белков.

Для выделения очень стабильного фермента фосфоглюкомутазы применяют цитолиз под действием концентрированного аммиака. Эта процедура разработана и широко применяется при работе с «активными сухими» дрожжами. Ее используют для получения прозрачных экстрактов, содержащих большую часть гликолитических ферментов. Некоторые ферменты полностью разрушаются при высоких значениях рН. При использовании этого метода протеолиз не представляет серьезной проблемы, так как активность протеаз достаточно низка при рН 9,5-10. Эффективность экстракции может значительно варьировать в зависимости от партии дрожжей.

2.2.4. Методы, используемые при очистке белков и ферментов, ассоциированных с частицами

Ряд специфических методов широко используются для выделения белков и ферментов, структурно связанных с нерастворимыми компонентами клетки, такими, как митохондрии, хлоропласты, плазмалемма, эндоплазматический ретикулум и ядерные мембраны. Эти методы не применяются к водорастворимым белкам, заключенным внутри органелл, например к белкам митохондриального матрикса, а лишь к молекулам, ковалентно связанным или прочно ассоциированным с частицами. Существенной степени очистки по сравнению с исходным материалом

33

можно добиться, многократно промывая гомогенат буфером, в котором данный белок не растворяется. После этого возможны два подхода к решению проблемы. Можно фракционировать осадок методом дифференциального центрифугирования (седиментация или градиент плотности), с помощью электрофореза или «молекулярных сит».

Другой способ заключается в солюбилизации белков (субфракционирование, конечно, может предшествовать солюбилизации). Не все ферменты способны существовать в солюбилизированном состоянии, будучи изолированы от их нормального клеточного окружения; поэтому успех очистки таких соединений зависит от того, насколько полно можно отделить фрагменты частиц, содержащие фермент, от прочего корпускулярного материала.

Белок, связанный с частицами, может быть солюбилизирован различными путями. Во многих случаях солюбилизированные белки ведут себя в дальнейшем как все водорастворимые белки, и их фракционирование может быть проведено с помощью процедур, описанных в гл. 3-5. С другой стороны, иногда возникает необходимость солюбилизировать вещество, используя детергенты. В этом случае детергент, связанный с белком, замещает липидсодержащую мембрану. Если впоследствии детергент удаляют, белок может денатурировать или, по крайней мере, агрегировать и выпадать из раствора.

Большая часть подробно изученных мембраносвязанных белков и ферментов относится к первой категории: их можно выделить с помощью физических, химических или энзиматических методов; полученный раствор фракционируют далее обычным способом. Много таких ферментов содержится в митохондриях, в том числе ферменты, ассоциированные с системой переноса электронов. Для их выделения используют следующие методы:

а) Разрушение митохондрий для выделения белков матрикса с последующим выделением мембранных белков из митохондриальных фрагментов с помощью 1) ультразвука, особенно при высоких значениях рН и повышенной температуре, 2) щелочи (рН 8-11) в присутствии или отсутствие агентов, образующих хелаты металлов (ЭДТА), 3) солюбилизации под действием детергентов, 4) органических растворителей (например, получение ацетонового порошка, экстракция н-бутанолом, этанолом и т.д.), 5) фосфолипазы А для расщепления липидов мембраны.

б) Классический способ, до сих пор находящий применение и заключающийся в экстракции липидов и получении ацетонового порошка. Суспензию частиц обрабатывают несколькими объемами ацетона при очень низкой температуре (например, -20°С или ниже). Полученный таким образом обезвоженный порошок может храниться долгое время. Белки растворяют, диспергируя их в водном буферном растворе.

Большинство мембраносвязанных белков можно экстрагировать из мембран в присутствии детергентов, в состав которых входят липофильные

34

цепи, взаимодействующие с гидрофобными поверхностями белка и вытесняющие его из комплекса с нормальной мембраной. Из детергентов, используемых для этой цели, наиболее широко применяются дезоксихолат натрия и тритон. Тритон - это торговое название целой серии в большинстве своем неионных детергентов на основе полиэтиленгликоля. Наиболее часто в различных целях используют тритон Х-100, хотя детергенты других типов также находят определенное применение. Особенно полезным является недавно описанное цвитерионное производное холевой кислоты. Детергенты способны вытеснять белок, прочно связанный с мембраной гидрофобными взаимодействиями, благодаря тому, что они, во-первых, растворяют мембрану и, во вторых, замещают компоненты мембраны алифатическими или ароматическими цепями, которые составляют липофильную часть детергента.

Если белок солюбилизирован и установлено, что его целостность не нарушена, можно провести фракционирование. В большинстве случаев это не представляет особой проблемы. Необходимо сохранить биологическую активность белка; это зависит от выбора подходящего детергента. Неионные детергенты, такие, как тритон Х-100, очень мягки по своему действию, и большинство белков, как связанных с мембранами, так и свободных, выдерживают концентрации тритона Х-100 до 1-3% (вес/об.). Напротив, некоторые анионные детергенты (например, додецилсульфат) обладают наряду с солюбилизирующими свойствами очень сильным денатурирующим действием. Они, по-видимому, не найдут широкого применения при выделении ферментов.

Липопротеины содержат ковалентноили нековалентно- (но прочно) связанный липид, который в свою очередь погружен в мембрану и служит связующим звеном между белком и частицей. Экстракция в присутствии детергента может привести к удалению липида и замещению его детергентом. Это может быть причиной потери ферментативной активности, которая восстанавливается при добавлении природного липида - обычно фосфатида. С такими белками особенно трудно работать, так как они очень чувствительны к соотношению в растворе детергента и липида. Удаление детергента неизменно ведет к агрегации и чаще всего к денатурации.

Избыток детергента может мешать фракционированию. На пример, высаливание сульфатом аммония приводит к появлению на поверхности раствора слоя тритона Х-100, в котором часто содержатся нужные белки. Однако эффективного разделения при этом не происходит. Можно провести колоночную хроматографию или отделить белки с помощью гельфильтрации, но не исключено, что мицеллы детергента будут двигаться в той же зоне, что и белок, и, следовательно, окажутся в одной фракции. Ионообменная хроматография успешно осуществляется в присутствии неионных детергентов. Действительно, тритон Х-100 в концентрации до 1 % оказывает незначительное влияние на ионообменные свойства нормальных водорастворимых белков. Но солюбилизированные белки мембран могут

35

находиться только в составе детергентных мицелл, что существенно влияет на процесс ионного обмена. Если исследуемый белок удается адсорбировать на ионообменнике, то избыток детергента свободно проходит через колонку. Это позволяет элюировать свободный (относительно) от детергента белок. С другой стороны, если полное удаление детергента приводит к денатурации белка, то, чтобы предотвратить это, в буфер вносят небольшое количество детергента (<0,1%). Собранная фракция будет, конечно, тоже содержать некоторое количество детергента. Тем не менее, так как обычно из смеси белков выделяют какой-то определенный фермент, присутствие в конечном препарате незначительной концентрации чистого детергента, не загрязненного жирами, не принесет большого вреда.

Белки, связанные с мембранами, очевидно, отличаются по растворимости от типичных цитоплазм этических ферментов, и для их очистки иногда применяются (и вполне успешно) некоторые необычные эмпирически найденные методы.

ГЛАВА 3. Производство аминокислот

В промышленности аминокислоты получают:

1)гидролизом природного белоксодержащего сырья;

2)химическим синтезом;

3)микробиологическим синтезом;

4)биотрансформацией предшественников аминокислот с помощью микроорганизмов или выделенных из них ферментов (химикомикробиологический метод).

Для гидролиза могут быть использованы отходы мясоперерабатывающей промышленности (отходы обработки животного сырья, кровь и т.д.), яичный белок, казеин молока, клейковина пшеницы, соевый шрот и т.д. При гидролизе белоксодержащее сырье нагревают с растворами кислот и щелочей, при температуре от 100 до 105 ºС в течение 20…48 часов. При этом аминокислоты переходят в гидролизат, и для выделения отдельных аминокислот необходима сложная многостадийная очистка. Кроме того, само сырье считается дефицитным и дорогим, поэтому аминокислоты имеют высокую себестоимость. Кроме того, может разрушиться часть аминокислот, таких как триптофан, цистеин, метионин, тирозин, а также происходит рацемизация.

Химический синтез аминокислот достаточно эффективен, однако его недостатком является то, что в процессе синтеза образуется смесь из биологически активной L-формы и D-изомера аминокислоты. D-форма является балластом, так как не усваивается животными и человеком, а некоторые D-формы аминокислот обладают токсическими свойствами.

36

Разделение изомеров – дорогая и трудоемкая процедура. Синтетически производится незаменимая аминокислота метионин.

концентрирование

стабилизация продукта обезвоживание

сухой продукт жидкий продукт хранение

применение

Рисунок 3 – Принципиальная биотехнологическая схема производства продуктов микробного синтеза

37

Наиболее перспективен и экономически выгоден микробиологический синтез аминокислот; 60 % высокоочищенных препаратов аминокислот получают именно этим способом. Преимущество его состоит в возможности получения L-аминокислот на основе возобновляемого сырья.

В последние годы широко используется биотрансформация предшественников аминокислот, полученных химическим синтезом с помощью клеток микроорганизмов или иммобилизированных ферментов.

Среди продуцентов аминокислот используются дрожжи (30 %), актиномицеты (30 %), бактерии (20 %).

Brevibacterium flavum и Corynebacterium glutamicum более трети сахаров превращают в лизин.

Для селекции продуцентов используются микроорганизмы,

относящиеся к родам Micrococcus, Brevibacterium, Corynebacterium, Arthrobacter.

Глутаминовая кислота – первая аминокислота, полученная микробным синтезом. Глутаминовая кислота относится к заменимым кислотам, обладает приятными органолептическими свойствами и находит самое широкое применение. Ее продуцентами являются бактерии Corinebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum и др.

Лизин образуют многие микроорганизмы: бактерии, актиномицеты, сине-зеленые водоросли, некоторые виды микроскопических грибов. В нашей стране в качестве продуцентов лизина используют бактерии родов

Corinebacterium (С. glutamicum), Micrococcus, Brevibacterium.

Триптофан образуют микроорганизмы бактериального и грибного происхождения: родов Micrococcus sp., Candida utilis, Bacillus subtilis.

Основными потребителями аминокислот являются сельское хозяйство и пищевая промышленность. Аминокислоты, чаще всего лизин, используют в качестве обогатителей кормов и пищевых продуктов растительного происхождения для повышения их питательной ценности и для сбалансирования пищи по незаменимым аминокислотам. Использование 1 т лизина в комбикормовой промышленности позволяет экономить от 40 до 50 т фуражного зерна.

Некоторые аминокислоты используют в качестве приправ, так как они обладают определенными вкусовыми свойствами и могут сообщать продукту приятные аромат и вкус. Большое распространение имеет глутаминовая кислота и ее натриевая соль (глутамат натрия), которая является эффективным усилителем вкуса мясных и овощных блюд. Данную аминокислоту добавляют во многие продукты при консервировании, замораживании и длительном хранении.

Для улучшения органолептических показателей мясных продуктов, придания им специфического приятного вкуса и аромата используют цистин, лизин, гистидин. Цистеин и цистин с глутаматом натрия создают имитацию запаха и вкуса мяса, что используется при приготовлении приправ.

38

Многие аминокислоты: лизин, аланин, пролин, валин и другие могут снимать неприятные запахи и используются в качестве дезодорантов пищевых продуктов.

Аминокислоты обладают оригинальным вкусом и участвуют в образовании вкусовых особенностей пищевых продуктов. Например, аспарагиновая и глутаминовая кислоты, кислые на вкус, в нейтральных растворах имеют очень приятный оригинальный вкус, глицин обладает характерным вкусом «освежающей» сладости, которая по интенсивности близка к сахарозе.

Особый интерес представляет подсластитель аспартам, молекулу которого образуют две аминокислоты – фенилаланин и аспарагиновая кислота. Эти аминокислоты синтезируются микробиологическим путем, а аспартам из этих мономеров – с помощью ферментов. Сладость аспартама в 200 раз превышает сладость сахарозы.

3.1. Биотехнология синтеза аминокислот и их очистка.

В последние годы широкое применение в народном хозяйстве и медицине находят различные аминокислоты. Особое значение они имеют для сбалансирования белкового питания. Некоторые пищевые и кормовые продукты не содержат в своем составе необходимых количеств незаменимых аминокислот, в частности лизина. К таким продуктам относятся пшеница, кукуруза, овес, рис и ряд других. Для ликвидации возможного дисбаланса аминокислоты используют в чистом виде или вводят в состав комбинированных кормов, выпускаемых промышленностью. Поэтому основной сферой применения аминокислот следует считать создание рационов, позволяющих понизить содержание растительных белков в кормах. Показано, что искусственные смеси аминокислот позволяют экономить расход естественных кормов. Кроме добавок к кормам сельскохозяйственных животных аминокислоты используются в пищевой промышленности. Применяются они и при изготовлении ряда полимерных материалов, например синтетической кожи, некоторых специальных волокон, пленок для упаковки пищевых продуктов. Ряд аминокислот или их производных обладают пестицидным действием. Метионин и γ- аминомасляная кислота широко применяются как лекарственные средства. Удельный вес применения аминокислот в различных отраслях хозяйства может быть продемонстрирован на примере Японии, где на долю пищевой промышленности приходится 65% всех производимых в стране аминокислот, на животноводство -18, для медицинских целей - 15 и на прочие нужды - 2 %. Мировой уровень производства аминокислот достигает в настоящее время нескольких миллионов тонн в год. В наибольших количествах в мире вырабатываются L-глутаминовая кислота, L-лизин, DL-метионин, L- аспарагиновая кислота, глицин. Основными способами получения аминокислот являются следующие: экстракция из белковых гидролизатов растительного сырья, химический синтез, микробиологический синтез

39

растущими клетками, при использовании иммобилизованных микробных клеток или ферментов, выделенных из микроорганизмов.

Микробиологический синтез - в настоящее время весьма перспективный и экономически выгодный способ получения многих аминокислот. В процессе культивирования Продуцентов аминокислот непосредственно синтезируются L-аминокислоты. Одна из важных задач микробиологического синтеза аминокислот - получение высокоактивных штаммов - продуцентов, в частности, с использованием методов генной инженерии. Именно таким способом в СССР получен высокоактивный штамм - продуцент L-треонина.

Кроме микробиологического синтеза аминокислоты можно получать, как указано выше, путем гидролиза природного белок-содержащего животного и растительного сырья. Это наиболее старый способ. Основным его недостатком является нерациональное использование сырья, которое с большой пользой может применяться в качестве белковых кормов или пищевых продуктов. Например, в странах юго-восточной Азии моноглутамат натрия получают из соевого шрота (обезжиренная соевая мука). В США описан способ получения аминокислот из клейковины пшеницы и кукурузного глютена, остающегося после отмывки крахмала. В равной мере, очевидно, могут быть названы и другие белки, однако их использование для получения аминокислот экономически невыгодно.

Химический синтез аминокислот достаточно эффективен, позволяет получить соединения любой структуры и организовать непрерывное производство при высокой автоматизации. В нем в основном используется непищевое сырье, достигается высокая концентрация продукта. Однако, как правило, процесс этот многостадийный и требует сложной аппаратуры. Главный недостаток химического синтеза - получение рацемической формы аминокислот. Пока не разработаны достаточно эффективные и дешевые пути разделения соединений на оптические изомеры. Химический синтез рентабелен для получения только тех аминокислот, которые могут быть использованы в виде рацемического продукта. Наиболее хорошо разработан химический синтез LD-метионина, главным потребителем которого является птицеводство. L- и D-изомеры метионина усваиваются организмами одинаково хорошо.

В последние годы имеются успехи в области асимметрического синтеза аминокислот, позволяющие избежать оптического разделения рацемических аминокислот. Новый подход к этой проблеме стал возможен благодаря открытию гомогенного каталитического гидрирования олефинов с помощью комплексов родия с фосфиновыми лигандами и разработке путей синтеза хиральных фосфинов. Применение комплексов родия с хиральными фосфинами в качестве гомогенных катализаторов для гидрирования N- ациламиноакриловых кислот позволило осуществить асимметрический синтез α-аминокислот с высокой степенью стереоспецифичности и хорошими выходами.

40