2.Культивирование вирусов в культуре ткани

Характеристика культур тканей. Культуры тканей (или культуры клеток)- это клетки тканей, выращенные вне организма на специальной питательной среде. Клетки ткани в искусственных условиях сохраняют присущий им обмен веществ и восприимчивость к определенным вирусам. Для культивирования вирусов особенно пригодны клетки с быстрым ростом. По этой причине широко применяют эмбриональные ткани (фибробласты куриных эмбрионов, клетки амниона человека и др., а также культуры клеток злокачественных опухолей). Для выращивания культур клеток наибольшее распространение получили синтетические и полусинтетические среды, которые содержат все необходимые вещества (соли, витамины, аминокислоты и т.д.). Например, среда 199, среда Игла, раствор альбумина бычьей плазмы, солевой раствор Хенкса с сывороткой.

Однослойные первичные культуры тканей - это взвесь клеток, полученная путем обработки тканей протеолитическими ферментами (трипсин, папаин и др.). Трипсинизацией достигается разделение клеток за счет переваривания межклеточного вещества. Такие клетки, помещенные в питательную среду, растут в виде монослоя и дают однослойную культуру ткани.

Перевиваемые клетки - это культура клеток, сохраняющая способность к размножению вне организма неопределенно длительное время. В лабораториях мира имеется много перевиваемых культур, полученных из нормальных тканей человека и животных: 1) штамм клеток Hela- клетки карциномы шейки матки человека; 2) штамм клеток Нер -2- клетки злокачественной опухоли гортани человека; 3) штаммы клеток Детройт 6- клетки, выделенные из костного мозга человека больного раком легких;

4) штаммы клеток А-О и А-I- клетки амниона человека; 5) штаммы клеток СОЦ- клетки сердца обезьяны и др.

Техника заражения культур клеток состоит в следующем. Берут пробирку с заранее выращенной монослойной культурой клеток. Вирус (например, вирус вакцины) разводят средой 199 в отношении 1:3 и обрабатывают антибиотиками. Из пробирки с культурой клеток стерильной пастеровской пипеткой отсасывают питательную среду. В пробирку вносят 1 мл разведенного средой вируса вакцины, плотно закрывают помещают в термостат в горизонтальном положении.

3.Обнаружение вирусов в культуре клеток

а) Изучение внутриклеточных включений. Универсальным методом окраски внутриклеточных включений является окраска по Манну. Внутриклеточные включения при бешенстве (тельца Негри) обнаруживается в нервных клетках аммонова рога и в клетках Пуркинье мозжечка. При окраске по Манну- тельца Негри красного цвета на голубом фоне цитоплазмы.

б) Цитопатический эффект (или цитопатическое действие)- это дегенерация клеток, возникающая под воздействием вируса размножающегося в культуре ткани. Микроскопически цитопатическое действие выражается в различных изменениях морфологии клеток.

в) Гемадсорбция – адсорбция эритроцитов на поверхности поврежденных вирусом клеток.

г) Метод бляшек предложен Дюльбеком для получения изолированных колоний вируса. Метод заключается в следующем. В специальном флаконе выращивают на стенке монослой клеток, затем удаляют питательную среду. Клетки заражают вирусом и заливают агаром, содержащим индикатор- нейтральный красный. Там, где происходит рост клеток, среда изменится в кислую сторону и индикатор окрасится в розовый цвет. На тех участках, где клетки погибли под действием вируса, рН среды и, следовательно, цвет индикатора не изменяется. Такие островки неокрашенной среды имеют вид беловатых бляшек.

д) Метод флюоресцирующих антител.

Основан на появлении специфического свечения в местах локализации вируса при обработке зараженной ткани флюоресцирующими антителами. Заражаемую культуру ткани выращивают на стеклянных пластинках. Препараты промывают физ.раствором, подсушивают и фиксируют ацетоном. Затем обрабатывают специфической сывороткой. Просмотр препарата производят с помощью люминисцентного микроскопа. В местах локализации вируса появляется специфическое свечение под воздействием флюоресцирующих антител.

е) Обнаружение вируса в культуре ткани методом «цветной пробы».

В основу «цветной реакции» положено то обстоятельство, что в процессе размножения и роста клеток в питательной среде накапливаются кислые продукты обмена веществ, сдвигающие рН среды в кислую сторону. В ткани, зараженной вирусом, наступает дегенерация клеток, метаболизм их подавляется и не происходит изменения рН среды. Для выявления этих изменений в питательную среду добавляют индикатор феноловый. При рН выше 7 цвет индикатора красный, при рН 7- оранжевый, рН ниже 7- желтый. Если клетки не заражены вирусом (или он нейтрализован специфической сывороткой) рН питательной среды сдвигается в кислую сторону, и она становится желтой. Если вирус размножается, то клетки дегенерируют и среда сохраняет исходный красный цвет.